绿叶挥发物合成相关基因及其生理生态功能

谢鑫鑫，林碧英，林忠平

(1.福建农林大学园艺学院，福建 福州350002;2.北京大学生命科学学院，北京100871)

近年来，绿叶挥发物(green leaf volatiles，GLVs)的生成及其功效逐渐受到关注。GLVs 由酯酶、脂肪酸氧化酶(lipoxygenase，LOX)和脂氢过氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase，HPL)共同作用所产生，是果蔬芳香气味的重要组成部分［1］。植物在正常生长状态下或受到机械损伤、病虫害等生物及非生物胁迫时均能产生GLVs，对植物生长发育调控和防御系统功能激活具有重要作用，这种生理过程涉及挥发性信号分子的产生、传导，并对邻近昆虫行为产生影响。

1 LOX 及HPL 代谢途径与GLVs 生成的关系

LOX 氧化底物为C18不饱和脂肪酸形成的脂肪酸氢过氧化物，有两条分解途径:(1)通过丙二烯合成酶(allene oxide synthase，AOS)形成植物激素茉莉酸(jasmonic acid，JA);(2)在HPL 催化下形成C6和C12，并在此基础上形成相应的GLVs［1］。绿色组织中，LOX 代谢途径在不同器官和环境下有显著差异。LOX 参与JA 和脱落酸(abscisic acid，ABA)的产生，JA、ABA 对植物生长发育有调节作用，也是植物适应环境的重要激素［2-3］。

1.1 LOX 基因的分离及其功能鉴定

大量研究表明植物GLVs 的形成与LOX 基因表达产物密切相关，并在拟南芥［4］、马铃薯［5］、番茄［6-7］、烟草［8］等植物中得到证实。目前已从多种植物中克隆了LOX 基因［9-10］。

植物中LOXs 可催化具有顺-1，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸进行加氧反应，生成含有共轭双键的过氧化氢物，在亚麻酸影响下迅速产生挥发性物质。植物中LOXs 主要分为13-LOXs 和9-LOXs 两类，大部分13-LOXs 存在于绿色组织中［11］，并多集中于气孔附近的叶绿体［9］。9-LOXs 与植物的生长发育、衰老、脂质过氧化作用、光合作用、伤反应及其他胁迫反应等有关，多存在于非绿色组织中，绿色组织仅少量含有，且主要分布在细胞质中［4］。LOX 对大豆、玉米、水稻等种子的风味和耐储性有重要作用［12-14］。

1.2 HPL 基因的分离及其功能鉴定

最早克隆的HPL 编码基因来自甜椒，依据序列相似性分类分析，甜椒HPL 编码基因与细胞色素P450家族相似［15］。根据底物特异性，细胞色素P450 家族中HPL 可分为13-HPL 和9/13-HPL 两个亚族。其中，西瓜种子［16］、茶叶［17］及甜椒［18］等属于13-HPL 亚族;黄瓜［19］属于9/13-HPL 亚族。9/13-HPL 亚族能同时催化13-和9-HPL 产生C6 醛和杀菌成分(E，Z)-2，6-二乙烯醛及(E)-2 壬烯醛［20］。郭凤芝等［21］对几种芸香科植物(九里香、柚以及金桔等)的HPL 基因也进行了克隆研究。

GLVs 参与植物直接和间接防御应答过程。植物受病原侵染而积累GLVs，包括13-和9-HPL 在内的产物对细菌和真菌早期入侵具有拮抗作用［22］，然而，过量积累GLVs 对细胞有毒害作用，产生植物超敏反应，甚至部分细胞程序性死亡［23-24］。Matsui et al［25］研究显示，HPL 诱导物招引害虫天敌也是一种间接的抗虫作用。赵凌等［26］指出HPL 催化产物不仅与植物抗病、抗虫有关，同时也是植物气味的主要成分。此外，HPL 还是食品和香水的重要添加剂，因此对HPL 的研究具有重要的经济价值。除醛类成分外，HPL 另一重要产物是创伤激素，该激素与组织创伤修复有关。关于愈伤激素的衍生物9-羟基-愈伤激素在大豆和苜蓿中得到鉴定［27］。

1.3 HPL 与LOX 的相关性

LOX 催化形成的酯氢过氧化物通常不稳定，在HPL 催化下会形成醛类和醇类，两者连续作用称为LOX-HPL 代谢途径，GLVs 是在LOX-HPL 途径下通过绿叶中复杂的代谢过程产生的［28］。在亚麻酸和亚油酸存在下形成醛类前体物质，如己醛和壬烯醛异构体等，并最终在乙醇脱氢酶的作用下形成C6 或C9醇类，这些混合性、挥发性成分组成植物特征性气味，称为绿色音符［29-30］。这些分子成分赋予产品新鲜度和真实性，在世界风味市场上的作用日益显著。

通过LOX-HPL 途径产生的GLVs 能够影响植物与环境间的关系。如挥发性植物抗毒素所传递的信号与植物防御系统功能的建成有直接关系;C6 挥发物可诱导花青素、植物抗毒素以及萜类的生成［22，31］。

1.4 GLVs 的产业化利用

激活LOX-HPL 代谢途径可增加GLVs，有利于抵御病虫害。已成功通过LOX 将脂肪酸大量转化成酯氢过氧化物［32］，由于HPL 在植物中稳定性差，通过HPL 对过氧化氢脂肪酸的转化产生芳香气味产物量低。通过9-LOX/HPL 途径中某些基因的调控，改变GLVs 生化过程，有利于作物产品风味改良，是未来有机农业发展的重要方向。

2 GLVs 的信号传导

2.1 激活GLVs 形成的各类信号分子

GLVs 的释放有助于植物防御病原和虫害。植物GLVs 均起始于LOX 途径的过氧化氢酶，GLVs 释放的增加源于非生物或病原的激活。所有与GLVs 相关的反应都是寄主植物与其攻击者间的一种反应，对此类长距离植物防御系统的信号传递，Heil et al［33］、陈书霞等［34］均做了详细的评述。未受到胁迫时，GLVs 的形成量很少，但激活后的几秒内便迅速形成，且防御作用能持续数天，这说明植物分子信息传递良好。这种防御信息可以传递给邻近植物，参与诱导邻近植物的防御反应被认为是植物的间接防御体系，说明GLVs 具有通用性，在植物适应环境过程中发挥着重要的作用［35］。GLVs 作为一种化学信息素，还可以帮助昆虫寻找食物和伙伴。

2.2 JA 及其衍生物的信号传递

植物可对外来胁迫做出相应的反应［33］。高等植物中普遍存在激素类信号分子JA 及其衍生物，在叶绿体内，亚麻酸通过LOX3、丙二烯合酶、醇脱氢酶等作用，转变成JA 类衍生物，这些成分还会通过维管束传输到植物体各个部分，推动下游基因表达。作为胁迫反应信号分子，JA 还涉及远距离信号传递，以气态形式的MeJA 扩散至植株不同部位乃至附近植物。另外JA 信号传导途径也能促进GLVs 及其他挥发性有机物的产生，使附近绿色群体产生获得性抗性，对减少群体虫害有重要意义。

2.3 萜类和乙烯类化合物的信号传递

绿叶光合作用细胞中与LOX-HPL 代谢相关的GLVs 的形成影响物种间信号的传递。近年来，学者们开始注意二乙烯基醚的合成，即二乙烯基醚合成酶(DES)代谢途径产物的作用。亚油酸和亚麻酸是近年研究较多的成分，其与植物抗虫性及农药的合成密切相关［36］。

3 GLVs 在种群关系中的生态学功能

物种多样性和挥发物多样性的形成是绿色生态环境优劣的重要指标［37］。植物不同发育阶段生成的挥发物不同。花、果是植物繁衍的最重要阶段，绿色组织是植物吸收能量、积累营养的主要部位，因此GLVs 对种群的稳定性起到重要作用。

3.1 GLVs 对大气与土壤的影响

近年来，关于植物气味物质成分与含量的研究越来越受昆虫学家和化学家的重视［38］。植物气味物质成分易发生变化，年龄、生理状态、空间分布、季节、土壤、光照等的变化以及某些微生物的存在都会影响植物气味物质的组成。植物挥发性次生物质包括烃类、醇类、醛类、酮类、有机酸、内酯、萜类、芪类、异黄酮等，参与调控昆虫的各种行为，包括取食、交配、聚集、示踪、报警等。植食性昆虫诱导植物释放挥发性成分的间接防御是植物防御系统的重要组成部分［39］。植食性昆虫化感器中有气味结合蛋白，植物在不同发育阶段会有不同受体蛋白对不同挥发物做出反应。目前，对气味结合蛋白转录组即关于信息素转录组的研究已见报道［34］。

3.2 GLVs 对物种间关系的影响

GLVs 具有远距离防御作用，使得生物群体间的生态关系更为复杂［28］。目前，学者们对这种关系的研究还不够深入，加强这方面研究对人工植被的建立和天然植被的保护具有重要意义［35］。

2010年美国生态学会专场讨论植物种群内和种群间信号传递对生态系统的影响［40］。Park et al［41］研究了植物释放的挥发物对昆虫嗅觉信号和视觉信号产生的影响，描绘了植物花卉释放信号成分的时空模式以及植物对昆虫吸引力和防御力的变化，引起学者的关注。

4 GLVs 的基因调控及其经济效益的提升

植物能释放各种挥发性有机化合物，该化合物及其降解物对植物生长发育和环境胁迫的适应性有很大影响［42］。

4.1 GLVs 与抗虫基因工程

Kos et al［43］通过调控植物遗传物质的生成，发现食草类动物和寄生蜂的危害明显降低。Christensen et al［44］获得玉米的Lox10 突变株，在田间和实验室条件下都证明了通过控制JA 或虫害诱导植物挥发物等成分的变化可以获得良好的抗虫品种，有利于形成良好的农业生态系统。Engelberth［45］研究表明，通过某些化合物激发GLVs 信号可以抑制虫害。Ninkovic et al［46］认为GLVs 在一定程度上可以降低蚜虫对马铃薯的危害。中国农科院茶叶所将茶叶中的HPL 基因导入番茄，显著强化了番茄对病虫害的防御能力，这一过程也与JA 的作用密切相关［47］。

4.2 植物精油成分的基因调控

薄荷、薰衣草、鼠尾草、香茅草、迷迭香以及樟树、桉树等挥发物，特别是精油成分的合成受到很大重视，其中包括通过基因调控增加萜类等成分的合成［48］，但许多产物形成于腺毛细胞中，与多数绿叶组织的代谢过程有所不同。张雪荣等［48］研究了腺毛细胞中芳樟合成酶基因的克隆和功能，发现农杆菌中宿主植物相关的rolC 基因在植物腺毛细胞中有较高的表达，因此rolC 启动子可用于调控腺体中挥发物的生物合成。另外，茶叶挥发物虽涉及饮品的质量，但目前深入研究尚少。

4.3 GLVs 与空气质量的关系

近年来，植物对大气碳平衡及大气成分影响的动力学逐渐引起国际学者的关注。全球每年65%以上的非甲烷挥发性有机物来源于植物排放，包括异戊二烯、单萜类、倍半萜类、醇类和酮类等物质［49］。挥发性有机化合物可与大气中的臭氧等反应，形成二次有机气溶胶，直接影响区域空气质量和人体健康，改变全球气候［28］。生物来源的挥发物主要包括异戊二烯、单萜、倍半萜烯等，有关其同臭氧等大气成分作用后产物的生理生化特性目前知之甚少，但在森林、草地等绿色环境中，植物挥发物对环境的净化作用有大量报道［50］。近几年部分学者开始关注GLVs 释放对空气质量的影响［51-52］，认为大气的有机物成分绝大部分来自植物，如转基因杨树能够提高环境污染的修复能力，利用的是卤代芳烃代谢途径中的关键基因细胞色素P450 的过量表达。当植物暴露于气态氯仿、三氯乙烯、苯等环境时，GLVs 能够迅速去除空气中的污染物［53］。

5 结论和展望

高等植物的绿叶不仅捕获太阳光能、固定CO2、积累营养物质，还可通过LOX 及HPL 代谢等途径产生短碳链挥发物，包括JA、SA 及其衍生物以及ET、萜类等成分。激活植物对不良环境的适应力是植物防御系统的重要组成部分。由于GLVs 在种群中发挥着信号传递的功能，使生态环境中物种间关系更加密切，尤其是人们发现大气中有机成分主要来自植物，在大气变化过程中生物挥发物成分的变化具有重要意义。大气中生物挥发物的循环变化已经开始引起学者的重视，对于农业上所关注的病虫害防治、生态环境维护方面等也应从探索GLVs 对物种间相互关系方面进行协调。

［1］GIGOT C，ONGENA M，FAUCOMMIER M L，et al. The lipoxygenase metabolic pathway in plants:potential for industrial production of natural green leaf volatiles［J］. Biotechnol Agron Soc Environ，2010，14(3):451 -460.

［2］VICK B A，ZIMMERMAN D C. The biosynthesis of jasmonic acid:a physiological role for plant lipoxygenase［J］. Biochem Biophys Res Commum，1983，111:470 -477.

［3］CREELMAN R A，BELL E，MULLET J E. Involvement of a lipoxygenase-like enzyme in abscisic acid biosynthesis［J］. Plant Physiol，1992，99:1258 -1260.

［4］MELAN M A，DONG X，ENDARA M.et al. An arbidopsis thaliana lipoxygenase gene can be induced by pathogens，abscisicacid，and methyl jas-monate［J］. Plant Physiology，1993，101(2):441 -450.

［5］KOLOMIETS M V，HANNAPEL D J，GLADON R J. Potato lipoxygenase genes expressed during the early stages of tuberization［J］. Plant Physiology，1996，112:44.

［6］GRIFFITHS A，PRESTAGE S，LINFORTH R，et al. Fruit-specific lipoxygenase suppression in antisense-transgenic tomatoes［J］. Postharvest Biology and Technology，1999，17:163 -173.

［7］HEITZT，BERGEY D R，RYAN C A. A gene encoding a chloroplasttargeted lipoxygenase in tomato leaves is transiently induced by wounding，system in and methyl jasmonate［J］. Plant Physiology，1997，114(3):1085 -1093.

［8］MARIO K，PAOLA A G，SILKE A，et al. C12derivatives of the hydroperoxide lyase pathway are produced by product recycling through lipoxygenase-2 in Nicotiana attenuata leaves［J］. New Phytologist，2011，191(4):1054 -1068.

［9］LIAVONCHANKA A，FEUSSNER I. Lipoxygenases:occurrence，functions and catalysis［J］. Journal of Plant Physiology，2006，163(3):348 -357.

［10］PODOLYAN A. A study of the green leaf volatile biochemical pathway as a source of important flavor and aroma precursors in sauvignon blanc grape berries［D］. Lincoln:Lincoln University，2010.

［11］GRECHKIN A N. Recent developments in biochemistry of the plant lipoxygenase pathway［J］. Progress in Lipid Research，1998，37(5):317 -352.

［12］田其英，华欲飞.大豆脂肪氧合酶研究进展［J］.粮食与油脂，2006(8):6 -9.

［13］程昕昕，耿广汉，李志成，等.玉米种子脂肪氧化酶LOX-3 缺失与耐贮性研究［J］.作物杂志，2011(3):34 -37.

［14］蒋家月，宋美，吴跃进，等.水稻种胚脂肪氧化酶Lox-1，Lox-2 缺失对种子储藏特性的影响［J］.激光生物学报，2008，17(3):395 -399.

［15］NOORDERMEER M A，VELDINK G A，VLIEGENTHART J F G. Fatty acid hydroperoxide lyase:A plant cytochrome P450 enzyme involved in wound healing and pest resistance［J］. Chembiochem，2001，2(7 -8):494 -504.

［16］NICK B A，ZIMMERMAN D C. Lipoxygenase and hydroperoxide lyase in germinating watermelon seedlings［J］. Plant Physiol，1976，57:780 -788.

［17］SHIBATA Y，MATSUI K，KAJIWARA T，et al. Purification and properties of fatty acid hydroperoxide lyase from green bell pepper fruits［J］. Plant Cell Physiol，1995，36(1):147 -156.

［18］HUSSON F，BELIN J M. Purification of hydroperoxide lyase from green bell pepper (Capsicum annuum L.)fruits for the generation of C6-aldehydes in vitro［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50(7):1991 -1995.

［19］TIJET N，SCHNEIDER C，MULLER B L，et al. Biogenesis of volatile aldehydes from fatty acid hydroperoxides:molecular cloning of a hydroperoxide lyase (CYP74C)with specificity for both 9-and 13-hydroperoxides of linoleic and linolenic acids［J］. Arch Biochem Biophys，2001，386:281 -289.

［20］CHO M J，BUESCHER R W，JOHNSON M，et al. Inactivation of pathogenic bacteria by cucumber volatile (E，Z)-2，6-nonadienal and (E)-2-nonenal［J］. Journal of Food Protection，2004，67:1014 -1016.

［21］郭凤芝，姜翠翠，冯会，等.九里香、柚花瓣HPL 基因保守序列的克隆与分析［J］.亚热带农业研究，2007，3(1):73 -76.

［22］BLEE E. Phytooxylipins and plant defense reactions［J］. Progress in Lipid Research，1998，37(1):33 -72.

［23］BUONAURIO R，SERVILI M. Involvement of lipoxygenase，lipoxygenase pathway volatiles，and lipid peroxidation during the hypersensitive reaction of pepper leaves to Xanthomonas Campestris pv.Vesicatoria［J］. Physiological and Molecular Plant Pathology，1999，54(5 -6):155 -169.

［24］CROFT K P C，JUTTNER F，SLUSARENKO A J. Volatile products of the lipoxygenase pathway evolved from Phaseolus vulgaris (L.)leaves inoculated with Pseudomonas syringae pv. phaseolicola［J］. Plant Physiol，1993，101(1):13 -24.

［25］MATSUI K，MINAMI A，HORNUNG E，et al. Biosynthesis of fatty acid derived aldehydes is induced upon mechanical wounding and its products show fungicidal activities in cucumber［J］. Phytochemistry，2006，67(7):649 -657.

［26］赵凌，沈文飚，翟虎渠，等.植物的脂氢过氧化物裂解酶［J］.植物生理学通讯，2004，40(2):135 -140.

［27］GARDNER H W，GROVE M J. Soybean lipoxygenase-1 oxidizes 3Z-nonenal:a route to 4S-hydroperoxy-2E-nonenal and related products［J］. Plant Physiology，1998，116(4):1359 -1366.

［28］SCALA A，ALLMANM S，MIRABELLA R，et al. Green leaf volatiles:a plant＇s multifunctional weapon against herbivores and pathogens［J］. international journal of molecular sciences，2013，14(9):17781 -17811.

［29］HATANAKA A. The biogeneration of green odour by green leaves［J］. Phytochemistry，1993，34:1201 -1218.

［30］KURODA H，OSHIMA T，KANEDA H，et al. Identification and functional analyses of two cDNAs that encode fatty acid 9-/13-hydroperoxide lyase (CYP74C)in rice［J］. Biosci Biotechnol Biochem，2005，69(18):1545 -2005.

［31］DUAN H，HUANG M Y，PALACIO K，et al. Variations in CYP74B2 (hydroperoxide lyase)gene expression differentially affect hexenal signaling in the Columbia and Landsberg erecta ecotypes of Arabidopsis［J］. Plant physiology，2005，139(3):1529 -1544.

［32］FAUCONNIER M L，MARLIER M. An efficient procedure for the production of fatty acid hydroperoxides from hydrolyzed flax seed oil and soybean lipoxygenase［J］.Biotechnol Technology，1996，10(11):839 -844.

［33］HEIL M，TON J. Long-distance signalling in plant defence［J］. Trends Plant Science，2008，13:264 -272.

［34］陈书霞，陈巧，王聪颖，等.绿叶挥发物代谢调控及分子机理研究进展［J］.中国农业科学，2012，45(8):1545 -1557.

［35］SHIOJIRI K，KISHIMOTO K，OZAWA R，et al. Changing green leaf volatile biosynthesis in plants:an approach for improving plant resistance against both herbivores and pathogens［J］. PNAS，2006，103(45):16672 -16676.

［36］VANCANNEYT G，SANZ C，FARMAKI T，et al. Hydroperoxide lyase depletion in transgenic potato plants leads to an increase in aphid performance［J］. PNAS，2001，98(14):8139 -8144.

［37］张艳良.保护生态环境对于生物多样性的重要意义［J］.科技信息，2010(35):1226，1236.

［38］郭雪飞，殷慧伟，严善春，等.植物挥发气味物质成分的收集与分析［J］.东北林业大学学报，1997，25(5):105 -109.

［39］ZHANG B，XI W P，WEI W W，et al. Changes in aroma-related volatiles and gene expression during low temperature storage and subsequent shelf-life of peach fruit［J］. Postharvest Biology and Technology，2011，60:7 -16.

［40］ADLER F R. Plant signalling:the opportunities and dangers of chemical communication［J］. Biology Letters，2011，7:161 -162.

［41］PARK J H，GOLDSTEIN A H，TIMKOCSKY J，et al. Active atmosphere-ecosystem exchange of the vast majority of detected volatile organic compounds［J］. Science，2013，341:643 -647.

［42］OIKAWA，P Y，LERDAU M T. Catabolism of volatile organic compounds influences plant survival［J］. Trends in Plant Science December，2013，18(12):695 -703.

［43］KOS M，HOUSHYANI B，OVEREEM A J，et al. Genetic engineering of plant volatile terpenoids:effects on a herbivore，a predator and a parasitoid［J］. Pest Management Science，2013，69(2):302 -311.

［44］CHRISTENSEN S A，NEMCHENK A，BORREGO E，et al. The maize lipoxygenase，ZmLOX10，mediates green leaf volatile，jasmonate and herbivore-induced plant volatile production for defense against insect attack［J］. Plant Journal，2013，74(1):59 -73.

［45］ENGELBERTH J. Selective inhibition of jasmonic acid accumulation by a small alpha，beta-unsaturated carbonyl and phenidone reveals different modes of octadecanoid signalling activation in response to insect elicitors and green leaf volatiles in Zea mays［J］. BMC Research Notes，2011，3(4):377.

［46］NINKOVIC V，DAHLIN I，VUCETIC A，et al. Volatile exchange between undamaged plants-a new mechanism affecting insect orientation in intercropping［J］. Public Library of Science One，2013，8(7):1 -9.

［47］XIN Z，ZHANG L，ZHANG Z，et al. A tea hydroperoxide lyase gene，CsiHPL1，regulates tomato defense response against Prodenia litura (Fabricius)and Alternaria Alternata f.sp.Lycopersici by modulating green leaf volatiles (GLVs)release and jasmonic acid (JA)gene expression［J］. Plant Mol Biol Rep，2014，32:62 -69.

［48］张雪荣，谭四军，吴韩英，等.植物腺体的萜类代谢工程［J］.生物技术通报，2007(3):49 -51.

［49］邵敏，董东.我国大气挥发性有机物污染与控制［J］.环境保护，2013，41(5):25 -28.

［50］彭瑞玲.植物挥发性有机化合物的分析及排放特征［D］.广州:中山大学，2008.

［51］BRACHO-NUNEZ A，KNOTHE N M，WELTER S，et al. Leaf level emissions of volatile organic compounds (VOC)from some amazonian and mediterranean plants［J］. Biogeosciences，2013，10:5855 -5873.

［52］PINTO D M，BLANDE J D，SOUZA S R，et al. Plant volatile organic compounds (VOCs)in ozone (O3)polluted atmospheres:the ecological effects［J］. Journal of Chemical Ecology，2010，36(1):22 -34.

［53］DOTY S L，JMES C A，MOORE A L，et al. Enhanced phytoremediation of volatile environmental pollutants with transgenic trees［J］. PNAS，2007，104(43):16816 -16821.