生物温度适应的分子生态学研究进展

何 璐，虞 泓，袁理春，刘海刚，鲍忠祥，代建菊

(1.云南大学生命科学学院，云南 昆明650091;2.云南省农业科学院热区生态农业研究所，云南 元谋651300)

分子生态学主要利用分子生物学的方法研究自然、人工种群与其环境的关系以及转基因生物所带来的一系列潜在的生态学问题。分子生态学是在蛋白质、核酸等水平上研究和解释有关生态学和环境问题的学科［1］。生物的生态适应研究错综复杂，涉及多方因素的问题，许多学者从不同层次，包括个体、物种、种群、群落以及生态系统加以研究，发现不同的生态因子之间具有协同作用、耦合效应以及交互机制。因此，从单一的生态限制因子入手，针对与之有关的具体生态现象，探索生物大分子与环境变化间的关系和响应机制是揭示生态适应问题的一条现实途径［2］。

温度是一种基本的生态因子，任何生物体都有其生长温度范围和最适生长温度。温度胁迫是种群适应性反应的进化动力之一，长期剧烈的温度变化很容易引起物种分化甚至新物种的形成。近年来，从低等生物细菌到高等动植物，越来越多的研究从不同方面探讨生物对环境温度适应的机理。种群和个体对温度胁迫的反应，或选择更适宜栖境，或改变自身的行为状态，如进入休眠或滞育，同时从生理上对温度胁迫选择采取积极响应。本文从分子生态学的角度，揭示了生物温度适应的生态学过程。一方面，温度引起生物体变化，生物体不同层次发生反应;另一方面，生物响应温度的变化，发生温度补偿适应，以相关分子或蛋白为基础，发生一系列生理生化过程，最终实现生物对温度的生态适应。生物温度适应问题的研究，一方面有利于在理论上阐明生物进化、自然选择等原理，另一方面在实践上对物种的遗传改良和定向培育也具有指导作用。

1 生物适应温度的层次

生物的温度适应性在细胞水平、酶分子、蛋白及基因水平均有体现。低温适应从保护细胞膜完整性开始，到产生蛋白形成低温保护，再到形成信号蛋白维持正确的信号通路，发生相应的分子过程，提高生物体能量，维持新陈代谢的平衡，适应环境温度变化，从多层次、多水平上实现温度适应。

在总结多年生草本植物适应低温及霜冻的分子机制时，Sandve et al［3］提出了多年生草本植物适应低温总体可分为3 个层次:首先，低温结合高光强引起胁迫和生理反应，水分子结合形成冰晶，质外体内组织液结冰对细胞膜产生直接的生理压和渗透压，引发叶绿体的光抑制;其次，低温胁迫反应产生一系列的基因及蛋白的变化，进行转录调节、信号(如转录因子CBFs 等)转导、能量代谢以及光合机制调控，并产生一些蛋白或酶，如重结晶阻断蛋白(ice re-crystallization inhibition proteins，IRIPs)和果聚糖，直接或间接保持了细胞膜的完整性;最终，已知或假设的相关生理过程发生，避免了冷害和结冰对细胞的破坏，使植物存活下来度过冬季。进一步研究表明［4］，低温细菌与古菌形成了多层次的低温适应机制。它们通过细胞膜脂类的组成来调节膜的流动性，维持正常的细胞生理功能;利用相容性溶质、抗冻蛋白、冰核蛋白及抗冰核形成蛋白等实现低温保护作用;产生冷激蛋白、冷适应蛋白和DEAD-box RNA 解旋酶保持低温下RNA 的正确折叠、蛋白质翻译等重要的生命活动;另外还产生低温酶，提高能量产生和储存效率等以适应低温环境。低温蛋白酶与中温和高温蛋白酶相比，其构象具有更高的柔性，能在低温下保持高催化效率。

2 生物对温度变化的响应过程

对温度的适应是有机体的整体行为，涉及不同层次特异蛋白质的连续表达，不同蛋白的表达过程之间可能存在级联关系。先期表达的小蛋白分子被证明有转录因子的作用［5］，从冷适应菠菜中所克隆的特异性因子可以影响基因的开放或关闭［3］。一些重要的生化过程反映了生物对温度的响应，其中DNA 甲基化、生物节律(生物钟)与生物对温度响应有关［6，7］。研究发现高温能引起菘蓝基因组甲基化模式的改变［8，9］。Steward et al［6］发现低温胁迫使玉米幼苗基因组甲基化水平降低。在热胁迫下，耐热基因型油菜发生去甲基化的比例高于不耐热基因型，表明DNA 去甲基化可能与植物对热胁迫的适应有关［10，11］。冷胁迫下，DNA 甲基化的变化具有组织特异性和位点特异性［12-15］。Sidote et al［16］的研究证明了温度对生物钟的影响。Bartok et al［7］研究表明，温度影响分子钟是通过基因片段的选择性拼接来实现，即高低温分别造成脉胞菌和黑腹果蝇基因片段发生不同剪接，引起生物钟相关基因PER、FRQ 的变化，最终实现分子钟的调控。目前有2 种温度诱导预测机制［17-19］:(1)温度直接作用于核心钟及其组成成分(如CRY、PER 和TIM 之间的相互作用)，影响它们积聚和降解的速度;(2)像光照诱导机制一样，存在一个含有类似热敏元件的输入通路及信号转换通路，与生物钟紧密接触。

3 生物适应温度的分子基础

早期研究中，在高温细菌中发现了耐热蛋白质，并阐释其生物学功能［20］。在鱼类中研究了抗冻蛋白基因的特性［21］，在植物中研究植物酶系统的多型性和对异常温度的抗性等问题，是研究生物适应温度的分子基础的开端。温度改变对于从细菌到哺乳动物的所有生物来讲是最常见的应激。应激性和适应性由遗传物质所决定，应激性的长期效应即为适应性。生物在适宜温度范围以外的适应表现分为热激反应和冷激反应，是研究温度适应的模式系统［22］。高温时热激反应主要涉及细胞中蛋白质的变性，使之在合成时不能正确折叠。为了克服这一问题，生物通过热诱导产生热激蛋白作为分子伴侣，协助蛋白质折叠，这些热激蛋白对于生物体适应高温至关重要。和热激相比，低温时的主要问题是低温使膜的流动性降低，减少了蛋白质的合成。为此，生物体通过部分地改变脂肪酸的组成来修复膜的流动性［23，24］。

3.1 热激反应

热激反应是外界温度升高时生物体对高温刺激的一种反应，主要表现为合成一些微量的进化上保守的蛋白及众多生理生化指标的改变。热激反应是一种快速反应，外界环境温度的升高会导致生物体基因表达的改变，高温抑制大部分蛋白质和mRNA 的合成，而生物体则表达一系列热激蛋白(heat shock protein，HSP)。这种随着温度的升高而快速表达的一类蛋白质被定义为HSP，最早在果蝇中发现［25］。大量研究表明，诱导型HSP 的累积决定着真核生物细胞的耐热性。热激条件下，HSP 可保护机体蛋白质免遭损伤，或修复已受损伤的蛋白质，从而对生物体起到保护作用。Waters et al［26］指出HSP 的表达是细胞受高温胁迫后在分子水平上最主要的响应之一。Mosser et al［27］在鱼类上发现HSP 的表达或降解与热适应性的出现或消失有密切的时空关系，昆虫、植物及哺乳动物等物种中均有类似现象［28］。

HSPs 根据其分子质量可分为:HSP100 家族(约100 -110 ku);HSP90 家族(约83 -100 ku)、HSP70家族(约66 -78 ku)、HSP60 及小HSP 家族((约15 -30 ku)以及泛素(约7 -8 ku)等，其中最主要的为HSP90 和HSP70 家族。HSPs 主要存在于细胞质、线粒体及内质网中。当热应激发生时，HSPs 被诱导表达，它们通过识别新生肽链、蛋白质的解折叠区域、暴露的氨基酸疏水链，维持、转运、重折叠应激变性蛋白并防止与其他胞内蛋白不可逆聚集，在细胞应激恢复和防止后继应激损害的细胞保护中发挥了重要作用［29，30］。动物有机体对热的胁迫抗性与HSP 表达量普遍成正相关。温和热处理能提高南美斑潜蝇(Liriomyza huidobrensis)的耐热性，显著增加HSP70 和HSP20 在mRNA 上的表达水平［31，32］。HSP 是刺参(Apostichopus japonicus)产生诱导耐热性的重要调控因子。高温驯化的刺参在热应激后，HSP70 大量表达，其热耐受能力的变化与体内HSP70 表达量的变化趋势一致［33，34］。HSPs 不仅与热激有关，在其他胁迫环境下也能被诱导。克隆斑潜蝇(Liriomyza sativae)3 种小分子HSP(HSP19.5、HSP20.8 和HSP21.7)和2 种HSP60 进行定量分析表明，3 种小分子均能被低温诱导表达，而且对低温更敏感，不同HSP 基因的相对表达量在不同生长发育阶段差异显著［35，36］。

HSPs 基因在热胁迫条件下的表达是受一类专门的转录因子——热激转录因子(heat stress transcription factors，Hsfs)调控。它们在HSP 基因转录时可与其启动子区热激元件(heat shock element，HSE)这一保守基序特异性结合，从而调控热激蛋白基因的开启与关闭，完成其相应的生物学功能［37］。热激基因的表达调节主要是在转录水平上进行的，而热激基因的转录需要Hsfs 来介导。HSE 是热激基因5＇端的一小段特异DNA 序列，是HSPs 有别于其他蛋白的特有上游启动子顺式元件。HSE 中的某些核心序列决定了基因转录的诱导，是Hsfs 特异性结合的区域，Hsfs 与HSE 的结合是HSP 转录激活所必需的。调控过程中转录因子Hsfs 是关键因素，在胁迫反应中它们不断合成并将信号传递和放大，调控下游基因的表达，引起抗逆反应。在植物中有20 多种Hsfs。番茄HsfAla 和拟南芥HsfA2 是诱导产生耐热性的主要转录因子，由HsfA2 诱导获得的耐热性具有物种特异性［38］。研究表明，钙—钙调素信号传导系统Ca2+-CaM 介导的信号转导途径参与热激反应的调控［39，40］。Ca2+-CaM 调控许多生理过程，可能是热激信号转导途径中的主要上游组分，通过调控Hsfs 活性，提高Hsfs 与DNA 的结合能力来激活热激基因的表达。其他信号如胞内pH、3＇，5＇环腺苷酸(cAMP)、1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)、蛋白激酶和蛋白磷酸酶等对热激反应也具有相应的调控作用。

HSP 是生物进化中最保守的蛋白家族之一。HSP 广泛地参与了DNA 修复、细胞分裂、细胞分化、形态建成、癌变及凋亡等多个重要的生理途径，被称为分子伴侣，甚至发现HSP 的过量表达可以补偿变异线虫和果蝇缩短的寿命［41，42］。HSP 基因的高度保守性和其调控系统显示了它们在整个生物进化时期的重要性［43］。目前这一领域的研究已应用于探讨生物的遗传、进化和环境适应等宏观问题。HSP 的主要功能有［44，45］:协助新生多肽折叠以形成功能构象及亚基组装，协助细胞器成分的胞内定位，恢复水解或解聚变性多肽的无序聚合体，调节供能系统等。热激反应的胁迫因子并非只是高温，其诱导表达与众多的胁迫因子有关，HSP 的表达和调控是生物在环境胁迫条件下产生应激反应的物质基础，但HSP 的诱导表达与生物的热适应能力最为密切。

3.2 冷激反应

冷激反应指环境温度在短时间内大幅度降低时，生物体出现的内环境及生理行为的变化。同热激反应相比，对冷激反应的了解很少。单细胞生物在外界环境急剧降温的条件下发生应激反应，所产生的一系列蛋白质称为冷诱蛋白(cold inducible proteins，CIPs)。使用蛋白质组学方法对乳酸菌中Latococcus lactis、Streptococcus thermophilus 和Lactobacillus plantarum 的冷激反应进行研究，Latococcus lactis 和Streptococcus thermophilus 中分别发现22 和24 个CIPs，表明不同菌种中CIPs 种类和数量不同。其中包括一些大约7 ku的酸性蛋白质叫做冷激蛋白(cold shock proteins，CSPs)，这是一种主要的应激蛋白。

细菌能适应比其最适生长温度低得多的低温环境。当细胞对迅速下降的生长温度做出反应时，CSP被强烈诱导产生，在细胞适应低温环境和增强抗冻能力方面发挥着重要作用。适冷菌和嗜冷菌的冷激反应合成大量的CSP，其数量随着冷激程度增强而增加。在大肠杆菌Escherchia coli 中发现了14 种低温诱导蛋白，其中CSPA、E、C 为主要的冷诱导蛋白，低温条件下大量表达，作为RNA 分子伴侣参与细胞中的mRNA 结合，稳定mRNA 促进翻译大肠杆菌［46］。大肠杆菌从37 ℃转移到10 ℃冷激，CSPs 中的CSPA 表达量增加200 倍，其合成占全部蛋白组成的13%，CSPA 家族是研究冷激蛋白的关键。CSPs 被认为是一种RNA 分子伴侣，CSPA、CSPB、CSPC 和CspD 都具有ssRNA 结合蛋白的功能，具有高度保守的冷激结构域(cold shock domain，CSD)。此区域与RNA 序列中一个含有ATTGG 的顺式作用元件(Y-box 模体)有很强的亲和力，使得CSPs 易与mRNA 结合［47，48］。

多细胞真核生物在冷应激时基因表达的改变主要是产生特定蛋白质使机体适应寒冷和低温，包括温度滞后蛋白、抗冻蛋白和抗冻物质等［49，50］。抗冻蛋白(antifreeze protein，AFPs)又被称为热滞蛋白(thermal hysteresis protein，THPs)，能够抑制冰晶生长，降低冰点，产生热滞活性，保护生物有机体免受结冰引起的伤害。AFPs 广泛存在于多种生物体中，如植物、鱼类、昆虫、细菌和真菌，在自然选择和平行进化作用下，这些蛋白质结构呈现多样性。植物AFPs 包括不含糖基和含糖基两种，具有热滞效应、冰晶形态效应、重结晶抑制效应3 个基本特征［51-53］。Yatnasaki et al［54］研究认为，各种抗冻蛋白是由不同的祖先独立进化而来的，但不同类型抗冻蛋白的作用机制却相同。

寒冷适应是生物机体的一种整体适应性变化，涉及到机体多系统、多层次的协调效应。生物膜在低温下的稳定机制是研究得比较清楚的重要寒冷适应机制之一。生物在低温胁迫下，通常会提高细胞内各类生物膜中不饱和脂肪酸的含量或提高支链脂肪酸的比例来增强膜的流动性，从而保证膜的物质运输、能量转换、信息代谢和代谢调节等生理过程的正常进行。但许多生物学过程和生物系统，如神经系统、内分泌系统以及细胞间、细胞内调节和信号转导，都有可能参与寒冷适应的调节，并且冷激反应也受到相应基因的调控，相关基因的变化和反应过程与机制十分复杂，有待于进一步的研究。

4 展望

温度是影响生物生存适应的重要环境因子，生物适应温度变化是一个逐级发生的、具有耦联机制的复杂过程。不同的基因、分子、蛋白等参与了该过程，最终出现适应或不适应的结果。将分子生态学技术和手段如DNA 技术和蛋白质分析技术应用于温度适应研究，能从更深层次即分子水平揭示温度适应的过程，是揭示生物与环境因子生态关系的重要手段和方法。

研究生物适应温度的分子生态机制，有利于在基因水平阐明温度对生物体的影响和基因、酶、蛋白等对温度变化的响应。在一些过程中，引起级联反应、信号转导等关键因子如热激蛋白等成为了研究的热点。通过对信号分子及通路的相关操作，将有望改造生物适应更宽温度变幅，提高生物的环境适应性。在生物体的温度应激过程中，一些与适应相关的基因或蛋白作为靶标开展研究，有利于医药开发、生物防治等应用研究的进行［55］。

在生物进化过程中，生物不断适应新的环境、新的温度范围，形成现有生物的丰富多样和分布格局，物种的消失和新物种的形成与生物的温度适应性密切相关。长期的温度适应是生物进化的驱动力之一。通过适应温度基因的克隆及其分子分析可以揭示适应的起源，为生物进化理论的研究提供科学依据，从功能上阐明生态学过程的分子机理。温度引起生物的变异反应在生物基因组上的证据是分子生态学的研究重点之一。生物适应温度的分子生态机制的研究将为生物进化的路线和物种的分类提供有力的分子生物学佐证，也可为更好地保护生物物种提供方法和手段。

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