苹果锈果类病毒山东文登峰山分离物的克隆

刘娟赵玲玲宋来庆姜中武,2*

1）山东省烟台市农业科学研究院·265500 2）烟台大学生命科学学院

苹果锈果类病毒山东文登峰山分离物的克隆

刘娟1赵玲玲1宋来庆1姜中武1,2*

1）山东省烟台市农业科学研究院·265500 2）烟台大学生命科学学院

苹果锈果病又名花脸病或裂果病，是严重影响苹果生产的主要病毒病之一。广泛分布于东北、西北、华北各苹果产区，目前仍有扩大蔓延趋势。其病原物为苹果锈果类病毒（App1e scar skin viroid，ASSVd），主要侵染苹果和梨，最新研究发现还可侵染桃、杏、樱桃核果类果树。感病苹果因品种和环境条件的变化果实表现为5种病状：锈果型、花脸型、锈果-花脸型、环斑型和绿点型，发病较重的果实发生畸形龟裂，大大降低果品的食用价值和经济价值。对文登峰山地区富士苹果进行ASSVd扩增和克隆，以期明确ASSVd在文登地区富士苹果上的变异情况。

1 材料和方法

1.1 材料

2013年5月在文登峰山采集4株富士苹果的嫩叶进行ASSVd扩增，样品编号分别为D1、D2、D3、D4。

RNA提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；反转录试剂盒购自Thermo公司；Taq DNA聚合酶（附10×Buffer，25 mmo1/L）、PMD18-T购自宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自TIANGEN生化科技有限公司；大肠杆菌DH-5α为本实验室保存菌株。

参阅Genebank中NC-001340序列设计特异引物：

反向引物：5′-CCGGCCTTCGTCGACGACGA-3′

正向引物：5′-TGAGAAAGGAGCTGCCAGCAC-3′用于扩增ASSVD的全长核苷酸序列，目的片段大小约为330 bp，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

总RNA提取：采用北京艾德莱公司的RNA提取试剂盒（型号RN09）提取叶片总RNA，溶解于40 μL ddH2O中，贮存于-70℃冰箱中备用。

RT-PCR体系：反转录过程：参照Thermo反转录试剂盒说明书进行。PCR扩增体系：10× Buffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、Mg2＋2.0 μL、正反向引物各1 μL(10 umo1/L)、CDNA 1 μL、TaqE 0.15 μL，总体积25 μL。反应程序：94℃预变性3 min，94℃变性45 s，58℃退后45 s，72℃延伸60 s，35次循环；72℃延伸10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

克隆测序：按照TIAN ge1 MidiPurification Kit说明书回收DNA目的片段，连接到pMD18-T载体上。取5 μL上述纯化后的目的片段和pMD18-T克隆载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。经蓝白斑筛选，挑取白色菌落进行PCR阳性克隆筛选。由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

将测序所得序列在GenBank中BLAST，然后用DNAMAN进行序列比对。

2 结果分析

2.1 ASSVd的RT-PCR检测

以病样中提取的总RNA为模板，利用设计好的引物进行RT-PCR反应，扩增得到大小约为330 bp的特异带，与目的片段大小一致（图1）。

2.2 变体序列比对

每个样品选取3个阳性克隆进行测序，将测序结果在GenBank中BLAST，确定为ASSVd，并获得5条ASSVd变体，以WS1～WS5表示，大小为330 bp、332 bp、333 bp、355 bp、358 bp。使用DNAMAN进行序列比对（图2）。序列比对结果中可以得出，5条变体的差异位点主要发生在232位点以后（WS1、WS2、WS3）或257位点以后（WS4、WS5）；WS4、WS5分别在124～148和124～151有连续片段插入。

3 讨论

目前，苹果锈果病的主要传播途径有带病枝条嫁接传播、修剪工具造成的污染传播、种子传播等3种。尚无有效的药物防止该病的发生，因而防治该病应以预防为主。可从以下几个方面预防该病发生：建立新苹果园时应远离梨园150 m以上，避免与梨树混栽；严格选用无毒接穗和砧木，培育无病毒苗木；不用修剪过病树的剪、锯修剪健树。

通过研究ASSVd的变异，可为该病的防治、流行规律的判断以及分子变异研究提供理论依据。本试验从文登的4个富士样品中，获得5条不同于Genbank中已登录的ASSVd新序列，并且5条变体的核苷酸序列存在较大差异，有关变体的致病性或毒性需要近一步研究。

泰山学者种业计划项目，国家现代苹果产业技术体系专项经费支持项目（CARS-28）

*责任作者,E-mai1:jiangzhongwu@163.com