小鼠皮质神经祖细胞分化过程中Twist1的功能

付红烨，阴 彬，彭小忠

（中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005）

大脑皮质是哺乳动物中枢神经系统的组成部分，是完成学习、语言和记忆等各种生物学功能最主要的器官。神经系统起源于外胚层，发育早期，神经外胚层内陷闭合形成神经管，神经管前端的神经上皮细胞逐渐转化为神经祖细胞，最后发育成为大脑［1］。神经祖细胞分布于皮质内侧的室管膜区（ventricular zone，VZ），其增殖与分化受多种基因与信号通路的调控，例如，Wnt通路成员β-catenin可以通过调控转录因子Pax6维持神经祖细胞的自我更新［2］。

碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）模体是一种典型的转录因子结构域，含有此结构域的蛋白大多与转录调控、细胞分化以及命运决定相关，这类蛋白在机体发育过程中起到重要的作用。Twist是bHLH蛋白家族的成员之一，最早在果蝇中发现，是果蝇原肠胚形成以及中胚层发育过程中的一个重要转录因子。Twist基因家族在人和小鼠等物种中非常保守［3］。Twist1是脊椎动物中Twist的同源基因，在小鼠中Twist1的功能与中胚层及神经嵴细胞发育相关［4-6］，而Twist1在大脑皮质发育中的作用少有报道，本研究以小鼠为研究对象，初步探讨Twist1在皮质发育过程中的表达及功能。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF级ICR小鼠［8～10周龄，26～30 g，北京维通利华公司，合格证号:SCXK（京）2012-0001］;HEK-293ET细胞系（中国医学科学院基础医学研究所蒋澄宇教授馈赠）;pGEM-T质粒载体（Promega公司）;pCAGIG质粒载体（耶鲁大学钟伟民教授馈赠）;DNA聚合酶、DNA体外转录试剂盒及RNA反转录试剂盒（Takara公司）;DNA内切酶（New England Biolabs公司）;DNA凝胶纯化回收试剂盒及质粒小量提取试剂盒（天根生化科技有限公司）;去内毒素质粒大量提取试剂盒（Qiagen公司）;Twist1抗体（sc-15393，Santa Cruz公司）;PAX6抗体（PRB-278P，Convance公司）;地高辛标记的 NTP、地高辛抗体、NBT/BCIP显色试剂（Roche公司）;DMEM完全培养基、胎牛血清（HyClone公司）;Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）。

1.2 Twist1基因过表达克隆的构建

Twist1基因序列获取自NCBI核酸数据库，扩增基因编码区的引物如下:正向:5'-CTCGAGCCACCA TGATGCAGGACGT-3'，反向:5'-GAATTCTAGTGGG ACGCGGACATGGA-3'。PCR片段及载体的酶切及连接反应按说明书操作进行，将基因片段与pGEM-T连接用于测序及探针制作。Twist1的过表达克隆所用载体为pCAGIG，pCAGIG载体在多克隆位点后含有一段内部核糖体进入位点序列（internal ribosome entry site，IRES）起始的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）编码序列，过表达基因的同时也会介导GFP蛋白表达，绿色荧光可以示踪转染后的细胞。质粒提取按试剂盒说明书操作。

1.3 细胞培养与转染

HEK-293ET细胞培养基为:DMEM完全培养基+10%胎牛血清，培养条件为37℃、5%CO2，细胞隔天传代1次，传代比例1∶5。用作转染时，铺板细胞浓度为2×108/L，铺板24 h内细胞汇合达到80%左右时转染质粒，质粒终浓度1.6 mg/L，以不含基因过表达序列的空载体作为对照，按照Lipofectamine 2000说明书步骤操作，48 h后检测细胞内蛋白表达水平变化。

1.4 Western blot检测Twist1蛋白表达

贴壁细胞弃去培养基后用生理盐水洗两次，加裂解液提取总蛋白。细胞总蛋白裂解液配方为:50 mmol/L Tris，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA和1%Triton X-100，用前加入蛋白酶抑制剂。冰上裂解，4℃ 12 500 r/min离心30 min，收集上清。按常规蛋白变性凝胶电泳进行分离，Western blot检测 Twist1蛋白表达量变化，Twist1抗体稀释比例1∶200。

1.5 原位杂交检测Twist1在皮质中的表达

实验选取 E12.5、E14.5、E16.5和 E18.5等4个发育天数小鼠脑组织，进行mRNA原位杂交实验，检测Twist1在皮质的表达情况。胚胎取出后用4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定10 h，25%蔗糖脱水，用冰冻切片包埋剂进行包埋，低温冰冻切片。Twist1原位杂交探针通过体外转录合成，通过测序检测序列与pGEM-T载体连接方向确定转录方向，以地高辛标记的NTP为底物，从基因的反方向转录出与编码序列互补的探针序列，转录按照Takara体外转录试剂盒说明书操作。原位杂交按照常规步骤进行，探针终浓度0.2 mg/L，地高辛抗体稀释比例1∶2 000，显色反应使用NBT/BCIP显色试剂，按说明书操作。

1.6 胚胎子宫内电转检测Twist1过表达效应

实验使用电穿孔转染Twist1过表达质粒，转染孕期13.5 d的ICR小鼠胚胎，使用0.7%戊巴比妥钠麻醉小鼠，注射及转染操作参照已发表文章步骤进行［7］，转染所用质粒为去内毒素的Twist1过表达质粒，浓度大于2 g/L，每只胚胎质粒用量约2 μL，电转所用电压为30 V。操作完成后缝合手术伤口，常规饲养，72 h后收取胚胎脑组织。组织切片按上述方法进行，切片用于免疫荧光实验，PAX6抗体稀释比例 1∶300。

2 结果

2.1 Twist1在大脑皮质的表达

组织切片的原位杂交结果显示，Twist1在小鼠皮质发育的4个时期均有表达，表达部位主要位于室管膜区，皮质中也有一定表达（图1）。

2.2 Twist1过表达克隆的验证

HEK-293ET细胞转染Twist1过表达质粒48 h后，可见转染细胞表达GFP蛋白（图2A）。Western blot免疫印迹结果显示，相比对照组，Twist1过表达以后可以检测到蛋白表达量升高（图2B）。

2.3 Twist1在神经祖细胞中的功能

在体转染Twist1过表达质粒后皮质组织细胞可以表达GFP（图3A），基因原位杂交也可以检测到Twist1过表达（图3B）。免疫荧光分析结果显示，相比对照组，过表达Twist1后分布于室管膜区神经祖细胞区GFP阳性细胞减少约18%（P＜0.01），中间前体细胞区GFP阳性细胞增多约15%（P＜0.05）（图3C－E）。

3 讨论

基因表达调控是细胞分化的基础，比如神经祖细胞中转录因子Pax6、Tbr2和Tbr1的依次表达，调控神经祖细胞向神经元分化［8］。Twist1作为转录因子，参与到多种信号通路的调节。

图1 Twist1在皮质不同发育时期的表达Fig1 Expression of Twist1 at different developmental stages（×100）

实验利用Twist1编码区反向互补序列为探针检测Twist1在大脑皮质不同发育时期的表达，探针的长度覆盖了基因的全长，可以保证更好的特异性，过表达基因以后原位杂交显示出的信号，也证明了反向互补序列探针是特异的。原位杂交显示Twist1表达于大脑皮质发育的各个时期，并且在神经祖细胞中的表达相对较高，提示其可能在祖细胞中发挥一定的功能。在体过表达实验结果表明，过表达Twist1以后室管膜区的祖细胞更多分化为中间前体细胞，并迁移出室管膜区。这一现象与早期研究中发现的Twist1促进上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相符［9］。

图2 Twsit1在HEK-293ET细胞中的过表达检测Fig 2 Overexpression of Twist1 in HEK-293ET cell line（×200）

Twist1最初在发育过程中发现，后期研究表明在肿瘤发生过程中也有着重要的作用，而Twist1与Wnt信号通路、BMP信号通路等都有紧密的联系。本研究从Twist1基因的表达谱出发，对Twist1在皮质发育中的功能进行了初步的探讨，为其调控通路的进一步研究打下基础，也提示神经发育与神经肿瘤发生在研究上的相关性，为后续研究提供了新的思路。

图3 Twsit1在神经祖细胞分化过程中的功能Fig 3 In vivo function of Twist1 in neural progenitor cells（×200）

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