组织因子小干扰RNA在预防支架内再狭窄的研究进展

万康 综述 李健 审校

(青岛大学医学院附属医院心内科，山东青岛266100)

冠心病呈现逐步年轻化且发病率与日俱增的趋势。经皮冠状动脉介入治疗已成为治疗急性冠状动脉综合征(acute coronary artery syndrome，ACS)的重要手段，球囊扩张、金属裸支架或药物洗脱支架置入都可产生支架内再狭窄(ISR)问题，ISR是目前尚未解决的技术难题。研究发现:组织因子(TF)与冠状动脉粥样硬化的发病密切相关，TF水平升高与斑块破裂、经皮冠状动脉内成形术再狭窄、微血管再生呈正相关，应用TF途径抑制物[1]及其人工合成的TF抑制剂[2]均能降低TF活性，并能减轻内膜增生及抑制支架内血栓形成。从基因调节水平来解决ISR，可能成为真正解决ISR的方法。因此减少TF生成可有效防治冠状动脉ISR的发生。本文将对TF小干扰RNA(TF-siRNA)的调控机制、目前的研究进展及其临床应用等问题做一综述。

1 TF-siRNA的概述

1.1 TF及RNA干扰技术

TF即凝血因子Ⅲ，既可作为受体与其配体Ⅶa结合后启动外源性凝血途径，又可激活凝血因子Ⅺ启动内源性凝血途径，促进凝血酶原激活物的生成[3]，并能通过正向反馈机制加速血液的凝固。

近年研究发现，某些小的双链RNA通过促使mRNA降解，高效、特异性阻断机体特定基因表达，这种基因沉默技术被称作RNA干扰(RNAi)，其中21～25 nt的siRNA在细胞内直接触发RNAi，同时，不会造成非特异的基因表达抑制。反之，过多的siRNA会导致非特异的RNA降解。RNAi通路主要通过形成并激活RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)发挥作用，可通过两种通路共同导致翻译抑制[4]。

1.2 TF的化学结构及分布

TF即CD142，是分子量为47 kD(≈4.7×104)的单链跨膜糖蛋白，属于细胞因子超家族成员。TF含263个氨基酸:胞外区(219个氨基酸，可与FⅦ结合)、单一跨膜区(23个氨基酸)、胞浆区(21个氨基酸)。其基因定位于染色体1p21-1p22。

在生理情况下，细胞不表达生理活性的TF，血液循环中TF的水平极低，其在血管壁中的水平远高于血液循环。在病理情况下，如组织损伤、吸烟、高脂血症、糖尿病及心血管疾病等均可促使血管内皮细胞(VEC)、血管平滑肌细胞(VSMC)、血小板和动脉粥样斑块中TF高表达。TF也广泛存在于心肌细胞中[5]。在临床研究方面也证实，ACS合并高TIMI评分(＞4分)的患者血浆中产生的TF水平远高于TIMI评分(＜3分)的患者[6]，并且TF增加程度可预测患者心血管事件的发生。然而，对于TF的来源，仍有不少争议，如实验中培养的内皮细胞刺激后可表达TF，而体内通过内皮细胞表达的TF的证据非常有限[7]。

1.3 TF-siRNA的功能及生物学作用

TF作为唯一以跨膜蛋白形式表达的凝血因子，胞内段参与信号转导功能[8];胞外段除参与凝血反应外，还在动脉粥样硬化、血管生成及血管重塑等方面发挥重要作用。此外，TF可调控VEC、平滑肌细胞(SMC)的信号转导，诱导其迁移、增殖和分泌细胞外基质，促进内膜增生。总之，TF的生物学功能主要是通过依赖于信号传导和凝血活化这两个途径实现。应用TF-siRNA可明显抑制血管的形成，延缓稳定性斑块向不稳定性斑块进展的速度，减轻内膜增生，抑制支架内血栓形成;防治ISR的发生。既往利用反义RNA、抗TF抗体、重组TF途径抑制物[9]等抑制TF表达作用效果不太理想，而下调TF表达的RNAi技术是一种新兴的基因失活技术，具有不易降解、高度特异性、高效性、长期性等优点。目前对RNAi技术的研究已深入到基因表达调控、基因功能和基因治疗[10]等层面，利用RNAi技术沉默TF表达方法是当前研究的热点。

2 TF-siRNA递送载体研究的新进展

siRNA作为新型的基因治疗药物，其在体内有效发挥作用的关键，在于它能否高效地被递送至靶细胞并与靶基因结合，靶向递送siRNA是药物进入临床应用最主要的环节。良好的转染载体能有效保护siRNA到达靶细胞，发挥基因沉默效应。目前研究的问题主要集中在:siRNA导入机体的途径是否经过化学修饰[11]、表面电荷、载体的大小及给药载体的选择等方面。载体的大小是一个重要的参数，既要避免肾脏清除作用，又要保证其能顺利进入靶器官，应确保纳米粒子大于10 nm，而不超过150 nm。来自多数的文献报道认为，20～50 nm范围内的微粒比更大或更小的颗粒吸收更迅速。“理想的”载体应该达到上述标准，因而，不同的递送载体被研究及应用于临床。它们可以被分为两大部分:病毒类和非病毒类[12]递送载体。TF-siRNA递送载体同样需要具备上述条件，以下为TF-siRNA递送载体的简介。

2.1 siRNA病毒递送载体

病毒载体是最早被应用的siRNA体内递送方式，实验研究中主要是利用它来提供DNA质粒或前体分子诱导RNAi技术。较高的转导效率，是它们的一个有利特性。病毒载体作为基因传递的工具被广泛地采纳，但它存在致突变或癌变的潜能，对宿主免疫原性及生产成本高等问题，大大限制了它们的应用。针对这些缺点，研究人员也试图通过对病毒载体的改进来克服它们在临床应用中的弊端。如在重组腺病毒制备和扩增过程中，构建TF-siRNA的重组缺陷型腺病毒载体，可避免产生免疫原性的野生型病毒，在实验中显示较低免疫原性的特点，已经运用于评估基因治疗的一些临床试验。然而，运载药物进入临床之前毒性问题仍待解决[13]。

2.2 SiRNA非病毒递送载体

非病毒载体递送效率较低，但具有安全性高且易合成等特性，更适合于临床疾病的治疗，近几年来对非病毒类给药载体的研究越来越受到关注。壳聚糖(chitosan，CS)、脂质体、去端肽胶原是目前最常用的转染TF-siRNA的非病毒类载体递送系统。

2.2.1 CS TF-siRNA 复合物

CS作为一种安全有效的非病毒载体，具有低毒性、低免疫源性、良好的生物相容性等优点。研究表明，CS纳米粒作为siRNA递送载体稳定性好，可通过人体最小毛细血管，穿透组织间隙及被细胞摄取，并能逃避被降解，延长siRNA作用时间。细胞吸收CS纳米粒复合物及随后从吞噬系统释放是转染过程中两个重要的限速步骤。已有研究表明，CS纳米粒比其他微粒有更高的细胞吸收率，而采用包封型CS-TPPTF-siRNA纳米粒在转染效率和基因沉默效应等方面比吸附型CS-TPP-TF-siRNA纳米粒效果更高[14]。CS纳米粒作为运送载体具有美好的应用前景。

2.2.2 脂质体TF-siRNA复合物

阳离子脂质体可通过静电作用与带负电荷siRNA相互作用，形成稳定的脂质体siRNA复合物。脂质体复合物表面电荷是细胞摄取纳米粒子最重要的给药参数。带正电荷的脂质体复合物首先沉积并黏附于细胞表面，然后通过胞吞作用穿过带负电荷的细胞膜脂质双分子层，通过动力蛋白定向运送到核周区，并迅速聚集在核周区，最后，siRNA从脂质体复合物中释放出来发挥作用。脂质体具有与细胞膜类似的成分，都是由磷脂和胆固醇构成;因此，具有脂质生物相容性，这是脂质体递送载体最大的优势。阳离子脂质体是一种很有前途的非病毒传递系统，并且已被广泛运用于TF-siRNA递送载体的实验研究，但也有报道，脂质体siRNA如不借助于转染试剂，不能保证高效的细胞摄取和基因沉默[15]效应，并且阳离子脂质体具有细胞膜活性，可能对细胞产生一定的破坏作用等问题，限制了它在体内的应用。

2.2.3 去端肽胶原TF-siRNA

去端肽胶原是一种经蛋白酶处理后得到的高纯度Ⅰ型胶原。研究结果发现使用去端肽胶原携带TF-siRNA[16]可稳定而缓慢释放siRNA，具有不需复杂的转染步骤等优点。

由于递送载体存在对机体免疫系统的不良反应，因此，既要减少对机体免疫系统的影响，又要保持siRNA对特异性靶基因的沉默作用，将成为今后研究的重要方向。

3 ISR的机制

支架置入术后造成管腔机械性损伤和血管内膜剥脱，露出胶原蛋白和TF，激活凝血级联反应，这可能会导致急性或亚急性支架内血栓形成，然而，在血管损伤处也可能会导致新生内膜增生，产生ISR。完全再内皮化可有效抑制新生内膜的增殖，可能从根本上解决ISR。ISR的机制包括:(1)VEC的损伤与增生;(2)VSMC的过度增殖与迁移[17];(3)血栓形成，细胞外基质的作用;(4)炎症反应;(5)血管弹性回缩及重塑。其中，VSMC的过度增殖与迁移可能在ISR中起着比较重要的作用。所有再狭窄过程均是基因治疗潜在的靶点，目前的研究主要是针对VSMC或VEC，使其表达特定基因或干扰某些基因的表达，发挥抑制ISR的作用。

4 TF-siRNA对VEC及SMC的影响

生理情况下，VEC释放的舒-缩血管因子处于动态平衡，VEC通过它所产生的血管舒缩因子实现对血管张力的调节，VEC处于易损的功能性界面，支架术后导致其功能障碍，主要是血管舒张功能受损。内皮损伤及功能失调是再狭窄发生的启动因素，损伤周边内皮细胞增殖、迁移修复可实现内膜的再内皮化。当支架置入术后，同时也会造成内皮细胞对SMC的接触抑制功能丧失，血管中膜的SMC可在血液中多种因子的刺激下，由非增殖性的收缩表型向增殖性的合成表型转化，由中层向内膜迁移，部分细胞增殖，最终，导致血管新生内膜形成，合成表型SMC的增生和迁移在ISR的发生进程中起着关键的作用[18]。VEC通过抑制循环生长因子和分泌SMC增殖的抑制因子，防止SMC的增殖[19]。因此，有完整的VEC的覆盖，可抑制SMC的过度增生及血栓形成，从而减轻细胞增殖引起的ISR，血管内皮快速修复是预防ISR发生的关键。研究表明，在动脉球囊损伤模型中，动脉中层平滑肌受损后，TF mRNA表达迅速上调;支架植入术后也可刺激人冠状动脉内皮细胞中TF的表达水平，同时伴随着TF蛋白水平的上调，但未上调 TF途径抑制剂[20];药物洗脱支架置入后本身可增加患者体内TF活性，促进动脉血栓形成[21]。外周血TF升高程度与介入局部SMC增生程度正相关，可能作为预测介入术后再狭窄的一项检测指标[22]。通过上调TF表达可缩短猪内皮细胞凝血时间，siRNA介导的TF表达抑制将延长凝血时间，也可延缓血管闭塞的时间[23]。通过TF-siRNA可明显抑制VSMC的增生，加速支架术后血管的再内皮化，减少ISR的发生。

5 TF-siRNA对新生血管生成的影响

TF及其信号通路在调解人血管生成中发挥了至关重要的作用。实验表明，TF在人微血管内皮细胞(HMVECs)和人微血管平滑肌细胞(HMVSMCs)中，HMVECs充当血管形成的调解器，HMVSMCs也发挥了重要作用，TF被证明在协调微血管形成方面起到了关键的作用。然而，TF沉默在VEC和SMC具有抑制管样结构形成的作用。研究也表明，沉默内皮细胞的TF抑制管样结构形成的作用比沉默在SMC的效果更加明显[24]。TF可诱导的VEC中的趋化因子配体-2(CCL2)释放，诱导相关的新生血管形成，其主要是通过转录调节因子-1CE26 transformation specific-1，Ets-1介导的基因转录，Ets-1活化调节 CCL2表达，招募SMC向内皮细胞迁移，促进新的微血管的成熟。因此，TF/Ets-1/CCL2轴在微血管生成和稳定的过程中发挥着重要的功能[25]。在内皮细胞中，TF形成一个复杂的信号机制诱导微血管的形成[26]，TF-siRNA可明显抑制微血管的生成。有研究表明，TF对血管生成的效应独立于血管内皮生长因子[27]。目前的研究已明确，斑块内血管新生是促进稳定性斑块向不稳定性斑块发展的重要机制，但尚无明确报道关于新生血管和临床上发生支架术后再狭窄之间的关系。

6 TF-siRNA与支架内血栓形成和ISR的应用前景

TF既是凝血始动因子，又直接促进内膜增生，并且贯穿血栓形成到血管重塑全过程。既往研究认为，血小板聚集增强是支架术后引发血栓形成的主要原因，但近年来大量研究结果表明，TF在支架术后血栓形成过程中可能起到更为关键的作用。而Morange等[28]研究认为，ACS患者血浆TF水平增高是评估心血管死亡风险的独立指标，他的研究同时也显示了TF途径抑制物水平与心肌损伤程度间存在一定关联。另有研究表明，TF途径抑制物除了与其抑制VSMC的迁移、抑制局部血栓形成、减少新生内膜增厚和减轻血管重塑外，还与其抑制VSMC的增殖及促进其凋亡[29]有关，也可防治 ISR 发生。Bis等[30]在一项研究中，报道了来自ACS患者的血浆中检测到了纳摩尔浓度的TF。由于TF病理性高度表达是凝血系统强烈且持久的激活因素，因此不但导致患者血栓形成的风险增加，血栓栓子体积增大，临床后果也更为严重[31]。由于在血栓形成和ISR过程中的关键角色，从基因水平抑制或阻断TF表达能有效减少TF生成，可产生与TF途径抑制物相似的效果。TF靶向治疗已开始成为研究支架术后血栓形成及再狭窄的重点对象。

7 TF-siRNA的临床应用前景

药物洗脱支架已大大减少早期的ISR的发病率，但局部的抗增殖治疗可能会干扰血管愈合及内皮化不全。TF siRNA能明显地抑制SMC的增殖，促进内皮细胞的生长，达到快速支架内膜再内皮化，这种基因治疗对于ISR具有美好的应用前景。有望从根本上解决ISR的发生，目前越来越多的临床试验正在评估RNAi疗法是否适合人类疾病的治疗[32]。未来的RNAi疗法有可能很大程度上依赖于RNA的设计及给药技术的改进，可通过提高药物疗效并减少脱靶效应而达到持续、高效、安全的效果。

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