椎间盘退行性变组织工程研究进展＊

白亦光 综述 冯 刚 审校

（川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院组织工程与干细胞研究所，四川 南充 637000）

腰椎间盘退变是引起下腰痛的主要原因之一，其一旦发生，难以逆转［1，2］。传统的治疗方法如微创［3］、介入［4］等治疗只能缓解临床症状，不能从根本上解决问题［5］。近年来，组织工程的出现，特别是髓核和纤维环组织工程研究的不断深入及自体椎间盘细胞移植修复髓核退变动物实验的初见成效，为此类疾病的治疗带来了光明的前景。利用组织工程方法修复退变的椎间盘是具有变革性意义的新的治疗探索。组织工程是以细胞为核心的生物移植工程，其核心内容包括：种子细胞，可供细胞贴附生长的生物支架或细胞外基质，用以促进组织再生的生长因子及基因修复技术。组织工程技术的兴起及其在临床不同领域的应用，为椎间盘退变疾病的治疗带来了新的思路。本文就椎间盘退行性变组织工程研究进行综述。

1 种子细胞

种子细胞指在组织工程中培养存活增殖最后形成组织的原始细胞，种子细胞是体外构建工程组织器官最为重要的材料。种子细胞一般需满足三个条件：①具有特定的分化表型或定向分化潜能。②容易获得的细胞来源及良好的体外扩增效率。③在体内不引发免疫排斥反应。

1.1 髓核细胞 髓核组织内的细胞在胚胎时期为脊索细胞，在正常成年人体内主要以类软骨细胞为主［6］。髓核细胞主要表达蛋白多糖和Ⅱ型胶原，在椎间盘维持脊柱稳定记忆承受压力方面发挥着重要的作用，但其体外增殖能力较弱，其组织内含量也极为有限，培养过程要求非常严格。Gan等［7］发现，在单层培养时，细胞增殖能力较强，而球状培养时，细胞形态会发生部分改变，而体内的髓核细胞也表现为这种特征，细胞活力强，但细胞的分裂增殖能力差，可以分泌大量的蛋白多糖等细胞外基质。他们认为髓核细胞由一维生长环境培养转变为三维生长的环境中时会细胞的特征可以得到部分恢复，体外的一些形态学及免疫组化的鉴定方法可以支持这些结论，他们认为这种特点的细胞可供椎间盘组织的修复。

1.2 骨髓间充质干细胞（MSCs） 许多动物实验研究显示，利用自体MSCs来阻止退变椎问盘的进一步发展或治疗已经退变的椎间盘，都获得了非常满意的治疗效果。由于MSCs为体内的一种多能分化干细胞，具有良好的分化特性。所以经常被用作组织工程的种子细胞。Sakai等［8，9］将 MSCs注射植入胶原基质中。MSCs可存活超过4周，将MSCs胶原基质复合体植入经髓核吸出术诱导退变的兔椎间盘后。椎间盘内蛋白多糖含量明显增加。Jeong等［10］用8只S－D大鼠尾部椎间盘造模处理后，将人类MSCs移植入大鼠尾部退变的椎间盘，观察MSCs在大鼠退变的椎间盘模型中的存活情况，结果显示，处理组的影像学表现为高度增加，髓核细胞结构恢复；而空白组的影像学显示髓核结构进行性破坏，高度进行性降低。上述研究结果表明，虽然自体 MSCs植入不能完全再生椎间盘，但是它确实能在某种程度上延缓甚至阻止椎间盘的退变过程。1.3 脂肪间充质干细胞（ADSCs） Ganey等［11］在利用犬自身的脂肪来源的干细胞修复受损的椎间盘实验中验证了ADSCs对受损椎间盘的修复作用。结果表明，由ADSCs修复再生的椎间盘治疗效果明显。随着椎间盘退变病因机制的认识逐渐深入，种子细胞研究的深入发展，特别是新型种子细胞的出现，如近年来的研究热点——诱导性多潜能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPS cells），在未来种子细胞研究中将占据非常重要的地位［12］。iPS细胞是通过使用逆转录病毒将四种转录因子（Oct4、Sox2、c－Myc和Klf4）载入小鼠皮肤成纤维细胞，筛选之后，发现其中具有干细胞形态的细胞群落并表达胚胎干细胞特异的表面抗原，且具有多能性、分化性［13］。iPS细胞技术的出现，为构建完整组织工程椎间盘研究和对IDD的细胞治疗带来了新的希望。

2 细胞支架

支架材料在组织工程研究中起着替代细胞外基质或组织、器官基质的作用，主要功能是为组织或器官体外构建提供立体的生长环境。较为理想的组织工程支架应具有如下特点：①良好的组织相容性。②良好的生物聚合性和降解性。③抗原性较低或缺如。④具有三维立体多孔结构。⑤有良好可塑性和力学性能［14］。

2.1 壳聚糖 壳聚糖是一种高分子聚合物，其分子结构与软骨基质糖胺多糖相似。壳聚糖在组织工程中具有广泛应用，具有无组织细胞毒性作用，良好的生物相容性和预防创伤性软骨退变等优点，其降解产物可作为硫酸角质素、硫酸软骨素的合成原料，是软骨细胞生长的重要物质［15］。

Roughley等［16］将磷酸甘油钠与壳聚糖混合，制备出包裹细胞的组织工程支架，研究者在支架上分别培养髓核细胞和纤维环细胞，结果表明这种水凝胶支架可以较好地保留髓核细胞分泌的细胞外基质，也更有利于髓核细胞的再生，壳聚糖–磷酸甘油混合支架不仅能促进髓核细胞生长，还具有一定的诱导作用，可诱导干细胞向髓核和软骨方向分化。Richardson等［17］将间充质干细胞种植到壳聚糖–磷酸甘油支架上，发现间充质干细胞存支架上培养4周后，能表达出髓核和软骨细胞的特异性基因SOX－9、COLⅡ和Aggrecan.表明这种支架可以诱导干细胞向髓核和软骨分化。壳聚糖支架的缺陷在于其机械性能较差，且在生理环境中降解过快，不能完全满足组织工程髓核支架的需求。这也限制了壳聚糖支架的进一步应用。

2.2 藻酸盐 藻酸盐具有低毒、组织相容性好、价格低廉等特点，可以作为组织工程材料。Iwashina等［18］认为，将兔椎间盘细胞种植于藻酸盐微球上，在一定强度超声脉冲干预下培养增殖，发现椎间盘细胞增殖更快且有更多的细胞外基质产生。

2.3 胶原 胶原是一种广泛存在于动物体内的天然蛋白质，常被用于制备组织工程支架。端胶原是胶原的一种衍生物，具有温度敏感性，在4℃以下保持液体状态，而在37℃下可以转变为凝胶。这种溶胶–凝胶的转变使得端胶原可以作为可注射的髓核组织工程支架。Daisuke等［19］以海藻酸盐支架作为对照组，考察了端胶原作为髓核支架的可行性，结果表明，在端胶原支架上生长的髓核组织的水溶性较好，能较好地保留髓核分泌的蛋白多糖，从而更有利于髓核组织的再生。

2.4 脂肪族聚酯类 脂肪族聚酯中聚乳酸、聚羟基乙酸及其共聚物聚。乳酸聚羟基乙酸共聚物是一类具有生物相容性，塑型简单，体内可降解吸收的合成高分子材料。Sha＇ban等［20］将纤维环及髓核细胞种植在纤维蛋白–聚乳酸聚羟基乙酸共聚物支架上获得良好的培养效果，认为此移植物有利于椎间盘退变的修复。Wan等［21］研究发现，软骨细胞能在聚合材料上存活，并分泌Ⅱ型胶原及蛋白聚糖等细胞外基质。

3 生长因子

多项研究表明，多种细胞因子与椎间盘细胞的分化增殖和细胞外基质的合成代谢有关。将这些细胞因子应用于动物实验，也表现出良好的作用效果。

3.1 转化生长因子–β（TGF－β） 基于TGF－β与椎间盘退变的关系，国内外许多学者通过多种途径探索TGF－β1阻止或逆转椎间盘的退变［22］。他们认为TGF－β1是一种较为稳定的多功能多肽生长因子，在动物体内具有重要的代谢作用，几乎参与了哺乳动物各种组织细胞的体内代谢过程，并能提高髓核细胞体外培养时的细胞外基质的合成及分泌作用［23］。Thompson等［24］也证实TGF－β1对犬椎间盘细胞体外细胞外基质的合成及分泌作用，认为TGF－β1对于髓核细胞的作用远比对纤维环细胞的作用强。

3.2 骨形态发生蛋白–7（BMP－7） 骨形态发生蛋白–7（bone morphogenefic proteins，BMP–7）由于其对软骨细胞纤维环细胞及髓核细胞合成代谢具有显著促进作用已成为国内外众多学者的研究热点［25］。An等［26］将BMP–7注入兔退变椎间盘，并以生理盐水作为对照。2周时注射BMP－7的椎间盘高度较生理盐水对照组高出15%，4周及8周时观察仍具有统计学差异。同时BMP–7还促进了椎间盘内蛋白多糖的合成。Imai等［27］使用软骨素酶ABC对新西兰兔髓核进行化学溶解，使得处理节段椎间隙高度下降获得椎间盘退变动物模型，将重组基因BMP–7注射入退变的椎间盘内，2周后发现处理组髓核组织内细胞外基质成分，如蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量等以及水分得到了很好的保持，椎间隙高度得到了部分恢复，并且高度一直维持到第3个月，此实验证实了BMP–7生长因子对于退变椎间盘内的髓核有明显的修复作用。此外，还有一些生长因子具有调整细胞的增殖、分化以及细胞基质代谢的作用。但需引起注意的是，现有的研究结果绝大部分来自动物实验和体外细胞培养，除物种差异外，椎间盘细胞的体外培养条件与体内椎间盘组织和细胞的内环境也有明显差异。

4 基因技术

RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是近年来发展起来的一项基因技术，可高效、快捷、特异地抑制目的基因的表达。MeCaffrey等［28］等将针对荧光素酶的siRNA和特异表达荧光素酶的质粒同时转染至成年小鼠的肝脏细胞，观察到荧光素酶的表达受到特异的抑制，证实了RNAi技术可以动物体内产生高效基因沉默效应。

Kakutani等［29］在实验中将双报告基因质粒（Firefly荧光素酶和Renilla荧光素酶）及针对Firefly荧光素酶的siRNA转染至体外培养的人和大鼠髓核细胞。观察到，在siRNA介导下人和大鼠髓核细胞中Firefly荧光素酶的基因表达受到显著抑制，作用持续达两周，而未见明显抑制外源性基因Renilla荧光素酶基因表达。由此证明，RNAi技术对椎间盘细胞内源性基因具有高效的基因沉默作用。

5 小结与展望

组织工程技术为失去功能的退变椎间盘组织的再生提供了可能性。但组织工程在椎间盘领域的研究相对较少，目前仍存在许多包括伦理道德和技术层面在内的问题。我们认为，在椎间盘退变疾病的治疗领域中，较为有希望的治疗策略是：在退变早期或者在椎间盘轻微退变时，采用基因治疗以及基于蛋白生长因子的治疗方法是有效的；而在中期，采用细胞治疗以及细胞联合基因和生长因子的治疗效果可观，而在椎间盘退变晚期，由于髓核及纤维环的细胞凋亡明显而且功能较差，恢复可能性小的情况下，我们认为采用整体椎间盘移植的方式较为合适。但由于体外整体椎间盘的合成组装目前并没有取得突破性进展，本实验室正在致力于这方面的研究，相信不久的将来，我们可以将组织工程技术用于攻克此类疾病。

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