内皮祖细胞与粥样斑块稳定性研究进展

吴倩倩 方涛 综述 齐国先 审校

(中国医科大学附属第一医院心血管内科，辽宁沈阳 110001)

动脉粥样硬化多见于40岁以上男性和绝经后女性，是一种慢性进展的炎性疾病，由内皮损伤、炎性细胞浸润、脂质代谢紊乱、神经血管功能失调等原因引起，表现为大、中动脉内膜出现含有胆固醇、类脂等的黄色物质，常导致急性心肌梗死、充血性心力衰竭、血栓形成、局部供血障碍等并发症，给人民健康带来很大威胁，是老年人的主要死亡原因。粥样硬化斑块引起并发症与斑块内新生血管密度增加密切相关[1]，新生血管可增加炎性细胞浸润及斑块内出血(intraplaque hemorrhage，IPH)风险，促进粥样斑块由稳定性向不稳定性转变，最终导致斑块糜烂或破裂。由骨髓衍生的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，一方面通过促进再内皮化恢复血管受损内皮的完整性，抑制早期阶段粥样斑块形成;另一方面可促进缺血缺氧部位的血管新生，增加斑块不稳定性。EPCs对粥样斑块形成及发展均产生影响，且在不同疾病阶段作用不同。本文将深入探讨EPCs与滋养血管的关系及对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响。

1 滋养血管新生与动脉粥样硬化斑块的稳定性

冠状动脉滋养血管来源于血管外膜，包括小动脉和小静脉的网络结构。显微CT(micro computed tomography，mCT)等显像技术表明，滋养血管有二级结构，一级结构起源于冠状动脉，延血管外膜纵向走形，二级结构为一级结构的分支，绕血管壁形成环形血管束[2]。在正常生物体内，血管壁的外膜由滋养血管供应营养物质，内膜由腔内氧弥散维持，未发现环形血管束。疾病情况下，血管内膜增厚，氧弥散功能障碍，结果滋养血管代偿形成环形血管束，满足血管壁营养需求。当供氧及营养物质得到满足后，滋养血管新生被抑制。

1.1 血管新生过程

血管新生是已有血管发芽生成新血管的过程，这一过程与血管内皮细胞迁移和增殖相关。胚胎发育过程伴随着血管发生及心血管系统的建立，出生后除伤口愈合，女性月经周期及一些病理过程(如癌症)外，很少出现血管新生。在器官移植、炎症、组织缺氧以及其他刺激下，促血管生成因子分泌增多，与抑制血管生成因子之间的平衡打破，从而启动血管新生的过程。首先，内皮细胞表面血管新生相关受体被激活;其次，活化的内皮细胞释放蛋白酶及纤溶酶以降解细胞外基质;随后内皮细胞迁移增殖形成萌芽结构，芽状结构扩大成环形，最终形成完整的血管腔[3]。

1.2 斑块内缺氧及炎症反应刺激血管新生

粥样硬化斑块的进展以炎症及内膜增厚为特征。在主动脉弓及股动脉粥样斑块处，使用氧气微电极检测发现，从血管外膜到中层含氧量呈明显的梯度改变，分别为50 mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)、0 ～15 mm Hg，直接证实氧气含量与内膜厚度负相关[4]。内膜增厚(超过100 μm)导致内膜到管腔的距离增加，影响氧气弥散，减少斑块内氧气供应[5]。在炎症因子刺激下，斑块内细胞代谢活跃，氧耗增加，局部呈现缺氧状态。因此斑块厚度与斑块内炎性反应是斑块缺氧的重要因素，当含氧量＜10 mm Hg(正常值20～100 mm Hg)，即供氧失衡后，缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)激活，上调多种促血管新生因子的转录及翻译，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，从而促进新生血管形成[6]。粥样斑块进展期脂质沉积，增加巨噬细胞浸润，刺激血管新生因子释放，形成炎症-缺氧-血管生成的恶性循环。

1.3 新生血管易引发斑块内出血导致斑块不稳定

随着年龄的增加及心血管危险因素的影响，粥样斑块形成并缓慢发展，逐渐加重形成不稳定斑块，最终斑块破裂引发严重并发症。1999年Moulton等就血管生成抑制剂TNP-470和endostatin作用于动脉粥样硬化动物模型，载脂蛋白基因敲除小鼠(apoE－/－mice)经过16周的治疗后，TNP-470和endostatin治疗组的斑块面积均比对照组显著缩小，两者对斑块增生的抑制率分别高达85%和70%，差异具有统计学意义;而治疗组和对照组的血液胆固醇水平和血管内膜斑块内的平滑肌细胞的数量无统计学差异。Moulton等[7]第一次从治疗的角度直接证实了血管新生是动脉粥样硬化发生发展的关键因素。2010年Hellings等[1]研究显示，患者斑块内巨噬细胞浸润、脂质核增大、钙化、胶原、平滑肌细胞数量与疾病结局无关，而斑块出血和斑块内血管密度增加是斑块破裂的独立危险因子，与疾病预后密切相关。

IPH为红细胞从新生血管外渗到斑块内的过程。有三个原因可以解释红细胞外渗:新生血管周围无周围细胞及血管平滑肌细胞支撑，相对脆弱;微血管内皮之间很少形成缝隙连接，通透性增加;新生血管缺乏完整的基底膜结构[8]。另外新生血管缺乏细胞外基质支撑也可能与红细胞外渗有关。新生血管破裂引起斑块内出血，红细胞、白细胞、血小板和血浆蛋白进入斑块内。红细胞细胞膜中含有40%胆固醇，远高于其他细胞，外渗到斑块内，经过分解代谢，形成斑块内胆固醇结晶，因而IPH是斑块内脂质核扩大的主要原因[8]。红细胞外渗后，细胞膜分解释放游离血红素，通过氧化应激反应形成高价铁离子(Fe3+)，影响斑块稳定性。白细胞及血小板外渗，促进斑块内局部炎症反应，增加巨噬细胞及EPCs等浸润。这些因素共同作用加重斑块负担，促进粥样斑块快速进展，由稳定状态向不稳定状态转变[9]。

2 EPCs与滋养血管新生

EPCs又名血管母细胞 (angioblasts)，分布于骨髓和外周血中，并可定居于血管外膜。目前由表面表达的 3 种标记:CD133+、CD34+、VEGFR+识别[10]，尚无EPCs的准确定义。从最初具有极度活跃的增殖能力，经历连续的分化阶段，逐渐失去有丝分裂能力，分化形成成熟内皮细胞，同时祖细胞特征性CD133表达减弱，细胞黏附因子表达增强，获得内皮细胞特性，如摄取低密度脂蛋白及释放一氧化氮(NO)。EPCs被视为有促进血管内皮再生和缺血组织血管新生功能的祖细胞。有研究表明CD133+EPCs有促进血管新生作用，而 CD133－EPCs则无此作用[11]。

循环EPCs数量及功能在不同的个体及疾病状态存在明显差异。粥样硬化危险因素影响循环EPCs的数量及功能，心血管危险因素包括:糖尿病、高血压、吸烟、高脂血症等，存在这些高危因素的患者中，循环EPCs的数量减少，功能缺失[12]。粥样硬化危险因素可导致内皮功能紊乱，而受损内皮再内皮化以保持内皮完整性的能力下降，是动脉粥样硬化形成的前提。粥样硬化是一种慢性进展的炎性疾病，如前已阐明，炎症因子与血管新生关系密切，在斑块发生发展中起到关键作用，那么炎症是否会影响EPCs的数量及功能?诚然，斑块内局部炎症反应增加血管新生，但是在慢性系统性炎症疾病中，C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)含量增高，削弱EPCs存活及分化功能，从而影响缺血区域血管新生能力。CRP同时作为预测心血管疾病的指标，可以看做炎症与心血管疾病发生的纽带[13]。Padfield 等[14]则表示:在急性血管损伤后，全身炎症反应引起非特异性的造血祖细胞动员，但并非EPCs动员的特异性刺激，因此认为全身炎症反应与EPCs无特殊关联。Ajijola等[15]研究表明，在小鼠模型中，规律跑步锻炼可以下调炎症因子水平且上调EPCs数量。循环EPCs数量还与患者长期用药、体内某些激素水平及血小板活化等都有密切关系。因此认为EPCs数量及功能受多种因素调控，粥样硬化患者虽大都存在心血管疾病高危因素，可减少EPCs数量及功能，但随着体育锻炼及体内激素水平变化等多种因素影响，在疾病各个阶段，EPCs数量多少不一而同。

EPCs参与血管内皮动态平衡及细胞修复过程，因此影响疾病早期斑块的发生。在生理情况下，血管单层内皮细胞的完整性依赖于EPCs归巢，刺激临近成熟内皮细胞增殖，取代凋亡内皮细胞，从而促进受损血管再内皮化，保护血管内皮完整性[16]。有实验表明，循环血中EPCs减少是粥样硬化疾病早期阶段的独立指标，在血管损伤模型中，直接静脉输入EPCs可减少新生内膜形成[17-18]。因此在粥样硬化发生早期，EPCs促进单层内皮细胞修复，抑制粥样斑块发展。然而随着年龄的增加和心血管病危险因素的影响，血管内皮氧化应激增加，EPCs数量及功能降低，导致内皮完整性遭到破坏，进而炎症细胞浸润及脂质沉积增加，粥样斑块形成;同时加重局部炎症反应及缺氧程度，诱导斑块内新生血管形成。

随着研究的深入，越来越多的实验结果证实:EPCs不仅参与胚胎时期血管的发生，同样参与到出生后血管新生过程中。EPCs经周围微环境刺激从骨髓处动员，在趋化因子作用下募集至缺血组织或受损内皮处，促进缺血区域血管新生。EPCs促进新生血管形成的机制主要有两个方面:(1)通过自身分化增殖成为成熟内皮细胞而形成新生血管，无需依赖原来的血管系统;(2)EPCs本身可以分泌VEGF或碱性成纤维细胞生长因子等，通过旁分泌效应促进局部血管内皮细胞迁移增殖，形成管腔样结构，即增强缺血区域血管生成效应，从而改善局部供血[19]。Meier等[20]提出使用粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)的患者EPCs及周围单核细胞数量明显增加，诱导侧支循环形成。目前已有临床实验证实:在人体内，EPCs参与出生后血管新生。值得注意的是，现在与粥样斑块相关的血管新生实验，多选择已存在粥样硬化的患者进行长期观察，通过观察疾病结局与循环EPCs数量关系得出相应结果，而无粥样硬化疾病及处于疾病早期阶段的患者未被研究，当然这与缺乏发现早期粥样硬化的技术手段不无关系，但是EPCs与粥样硬化的发生及在早期阶段对滋养血管的影响，是预防疾病的关键，值得我们深入探索。

3 探讨EPCs用于动脉粥样硬化患者的安全性

EPCs在血管机械性损伤模型(后肢缺血模型)中的血管修复作用得到了广泛认同，在心血管疾病，如急性心肌梗死患者中，自体移植EPCs可改善心肌缺血，减少心肌坏死范围并增强左室收缩功能[21]。但在动脉粥样硬化斑块内的作用尚不明确。首先，体内EPCs数量与粥样硬化斑块稳定性关系存在争议。Tousoulis等[22]表明，在小鼠粥样硬化模型中，无论是直接使用EPCs，还是间接动员造血祖细胞，都可减慢斑块的进展和炎症因子水平。Moon等[23]提出在2型糖尿病患者中EPCs减少，促进颈动脉粥样斑块形成。Silvestre等[24]则提出不同观点，在小鼠模型中，使用EPCs治疗后，斑块体积增加，但是其内含巨噬细胞、平滑肌细胞等比例相当，得出短期使用EPCs治疗不影响斑块稳定性的结论，虽然长期使用对斑块稳定性效果不明。其次，在冠状动脉狭窄实施介入治疗手术的患者中，EPCs与内膜增生导致支架内再狭窄关系不明。Werner等[25]短期观察结果显示，经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)患者中CD34+KDR+EPCs增高可减低患者心血管事件的病死率。George等[26]提出支架内再狭窄患者减少EPCs数量可加速细胞增殖，EPCs对内皮细胞有保护作用。与之相矛盾的是，Pelliccia等[27]研究表明，相对于对照组而言，PCI术后患者中再狭窄患者EPCs含量更高。其于5年后提出长期观察结果:发现行PCI患者中循环EPCs增高可增加患者心血管事件的病死率[28]。现今，EPCs在动脉粥样硬化发生发展中的作用尚不明确，实验结果存在偏差可能与其他危险因素干扰、获取患者血液标本时间不一致、患者行PCI术时处在不同的疾病发展阶段等有关。

综上所述，EPCs与粥样斑块关系尚不明确。Liu等[29]推论，祖细胞在疾病进程的不同时间点灌注，其结果是不一样的，不适当地增加EPCs动员或募集会加速动脉粥样硬化疾病的进程。根据已有数据推测:在粥样斑块形成早期，EPCs通过促进内皮增殖、抑制凋亡等，保持血管内皮细胞稳态，防止炎性细胞募集及粥样斑块发生。即早期EPCs数量增加可预防斑块形成。在晚期阶段，内皮损伤严重，难以完整修复，炎症细胞持续作用于粥样斑块，且EPCs促使血管壁滋养血管新生，新生血管破裂导致斑块内出血，体积增大转变为不稳定斑块。即疾病晚期EPCs数量增加通过促进血管新生，加速疾病进展。目前EPCs临床应用的安全性有待更多的研究探索。同时患有粥样硬化基础疾病的肢端缺血患者，应用EPCs治疗更应考虑引起严重心血管事件并发症的可能性。

4 展望

EPCs作为一种多能干细胞，促进受损内皮修复，且其促血管新生作用明显增强缺血区域血流供应，引起广大学者兴趣及关注。已有学者将EPCs应用于临床疾病治疗，如周围血管疾病造成肢端缺血，急性心肌梗死引起心肌坏死，效果令人瞩目。但是关于EPCs尚有很多领域不为人知，如EPCs的准确定义，而非简单根据细胞表面标记进行识别;EPCs促内皮修复及促血管新生的作用机制;EPCs旁分泌产生生长因子，在靶细胞作用的具体信号通路;EPCs与粥样斑块发生发展的关系等，这些问题仍然困扰着我们。需要更多学者加入到EPCs研究的队伍中，了解其与粥样斑块稳定性关系，确保将来祖细胞临床应用的安全性。

[1]Hellings WE，Peeters W，Moll FL，et al.Composition of carotid atherosclerotic plaque is associated with cardiovascular outcome:a prognostic study[J].Circulation，2010，121(17):1941-1950.

[2]Zagorchev L，Mulligan-Kehoe MJ.Advances in imaging angiogenesis and inflammation in atherosclerosis[J].Thromb Haemost，2011，105(5):820-827.

[3]Hillen F，Griffioen AW.Tumour vascularization:sprouting angiogenesis and beyond[J].Cancer Metastasis Rev，2007，26(3-4):489-502.

[4]Zemplenyi T，Crawford DW，Cole MA.Adaptation to arterial wall hypoxia demonstrated in vivo with oxygen microcathodes[J].Atherosclerosis，1989，76(2):173-179.

[5]Magnoni M，Coli S，Marrocco-Trischitta MM，et al.Contrast-enhanced ultrasound imaging of periadventitial vasa vasorum in human carotid arteries[J].Eur J Echocardiogr，2009，10(2):260-264.

[6]Lim CS，Kiriakidis S，Sandison A，et al.Hypoxia-inducible factor pathway and diseases of the vascular wall[J].J Vasc Surg，2013，58(1):219-230.

[7]Moulton KS，Heller E，Konerding MA，et al.Angiogenesis inhibitors endostatin or TNP-470 reduce intimal neovascularization and plaque growth in apolipoprotein E-deficient mice[J].Circulation，1999，99(13):1726-1732.

[8]Kolodgie FD，Gold HK，Burke AP，et al.Intraplaque hemorrhage and progression of coronary atheroma[J].N Engl J Med，2003，349(24):2316-2325.

[9]Michel JB，Virmani R，Arbustini E，et al.Intraplaque haemorrhages as the trigger of plaque vulnerability[J].Eur Heart J，2011，32(16):1977-1985.

[10]Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science，1997，275(5302):964-966.

[11]Estes ML，Mund JA，Mead LE，et al.Application of polychromatic flow cytometry to identify novel subsets of circulating cells with angiogenic potential[J].Cytometry Part A，2010，77(9):831-839.

[12]Hill JM，Zalos G，Halcox JP，et al.Circulating endothelial progenitor cells，vascular function，and cardiovascular risk[J].N Engl J Med，2003，348(7):593-600.

[13]Verma S，Kuliszewski MA，Li SH，et al.C-reactive protein attenuates endothelial progenitor cell survival，differentiation，and function:further evidence of a mechanistic link between C-reactive protein and cardiovascular disease[J].Circulation，2004，109(17):2058-2067.

[14]Padfield GJ，Tura O，Haeck ML，et al.Circulating endothelial progenitor cells are not affected by acute systemic inflammation[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，298(6):H2054-H2061.

[15]Ajijola OA，Dong C，Herderick EE，et al.Voluntary running suppresses proinflammatory cytokines and bone marrow endothelial progenitor cell levels in apolipoprotein-E-deficient mice[J].Antioxid Redox Signal，2009，11(1):15-23.

[16]Endtmann C，Ebrahimian T，Czech T，et al.AngiotensinⅡ impairs endothelial progenitor cell number and function in vitro and in vivo:implications for vascular regeneration[J].Hypertension，2011，58(3):394-403.

[17]Fadini GP，Losordo D，Dimmeler S.Critical reevaluation of endothelial progenitor cell phenotypes for therapeutic and diagnostic use[J].Circ Res，2012，110(4):624-637.

[18]Werner N，Junk S，Laufs U，et al.Intravenous transfusion of endothelial progenitor cells reduces neointima formation after vascular injury[J].Circ Res，2003，93(2):e17-e24.

[19]Abe Y，Ozaki Y，Kasuya J，et al.Endothelial progenitor cells promote directional three-dimensional endothelial network formation by secreting vascular endothelial growth factor[J].PLoS One，2013，8(12):e82085.

[20]Meier P，Gloekler S，Oezdemir B，et al.G-CSF induced arteriogenesis in humans:molecular insights into a randomized controlled trial[J].Curr Vasc Pharmacol，2013，11(1):38-46.

[21]Bai Y，Sun T，Ye P.Age，gender and diabetic status are associated with effects of bone marrow cell therapy on recovery of left ventricular function after acute myocardial infarction:a systematic review and meta-analysis[J].Ageing Res Rev，2010，9(4):418-423.

[22]Tousoulis D，Briasoulis A，Vogiatzi G，et al.Effects of direct infusion of bone marrow-derived progenitor cells and indirect mobilization of hematopoietic progenitor cells on atherosclerotic plaque and inflammatory process in atherosclerosis[J].Int J Cardiol，2013，168(5):4769-4774.

[23]Moon JH，Chae MK，Kim KJ，et al.Decreased endothelial progenitor cells and increased serum glycated albumin are independently correlated with plaqueforming carotid artery atherosclerosis in type 2 diabetes patients without documented ischemic disease[J].Circ J，2012，76(9):2273-2279.

[24]Silvestre JS，Gojova A，Brun V，et al.Transplantation of bone marrow-derived mononuclear cells in ischemic apolipoprotein E-knockout mice accelerates atherosclerosis without altering plaque composition[J].Circulation，2003，108(23):2839-2842.

[25]Werner N，Kosiol S，Schiegl T，et al.Circulating endothelial progenitor cells and cardiovascular outcomes[J].N Engl J Med，2005，353(10):999-1007.

[26]George J，Herz I，Goldstein E，et al.Number and adhesive properties of circulating endothelial progenitor cells in patients with in-stent restenosis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23(12):e57-e60.

[27]Pelliccia F，Cianfrocca C，Rosano G，et al.Role of endothelial progenitor cells in restenosis and progression of coronary atherosclerosis after percutaneous coronary intervention:a prospective study[J].JACC Cardiovasc Interv，2010，3(1):78-86.

[28]Pelliccia F，Pasceri V，Rosano G，et al.Endothelial progenitor cells predict long-term prognosis in patients with stable angina treated with percutaneous coronary intervention:five-year follow-up of the PROCREATION study[J].Circ J，2013，77(7):1728-1735.

[29]Liu P，Zhou B，Gu D，et al.Endothelial progenitor cell therapy in atherosclerosis:a double-edged sword[J].Ageing Res Rev，2009，8(2):83-93.