肽段固相等电聚焦结合液相色谱质谱联用技术分析鼠肝蛋白质

刘鸿　姚鋆　杨芃原　樊惠芝

摘要 利用肽段固相胶条等电聚焦技术对大鼠鼠肝组织蛋白质酶解产物进行预分离，反相色谱分离所得预分离组分后，用LTQOrbitrap MS进行分析。共鉴定到2039个蛋白质，包括18个乙酰化蛋白，其中4个乙酰化蛋白未被报道过。对这些蛋白进行了生物信息学分析。结果表明，将肽段等电聚焦与LCMS/MS结合起来，是一种有效的蛋白质组学分析技术，适合于大规模蛋白质鉴定分析。

关键词 固相等电聚焦； 液相色谱质谱联用； 鼠肝蛋白质

1引言

蛋白质的分离与鉴定是蛋白质组学研究的重要内容，但由于生物样品的复杂性，在进行蛋白鉴定分析前，往往需要预分离简化体系后再进行鉴定分析。蛋白质等电聚焦分离技术是一种有效的预分离方法，被用于蛋白质组学研究中，取得了很好的成果[1～5]。但蛋白质的液相等电聚焦在研究中存在一些问题，例如聚焦结束后需对分离的各组分蛋白质分别酶解，溶液中pH值不稳定，同时在线分析能力不强，所以科学家又发展了肽段固相等电聚焦的方法。

基于固相pH梯度（Immobilized pH gradients，IPG） 胶条的肽段等电聚焦分离技术（Peptide IPG IEF）是液相等电聚焦的重大发展。它利用传统的2 DE分离仪器，在IPG 胶条上对肽段进行等电聚焦分离。2008年，Hubner等[6]采用Peptide IPG IEF代替胶内酶解技术，将其引入蛋白质组学分析中。同年，Chick等[7]将Peptide IPGIEF与LCMS/MS联用，分析了鼠肝中的膜蛋白，他们通过此方法共发现了1549个非冗余膜蛋白。 2009年，McQuade等[8]将Peptide IPGIEF与LCMS/MS联用，分析了人类胚胎干细胞，这种技术提高了蛋白检测的覆盖率，是一种有效的蛋白质组学分析流程。 Peptide IPGIEF简便易行，上样量大（mg级），同时胶条上pH值稳定，并且对肽段的提取和后续处理非常简便，非常适合与LCMS/MS联用，是一种非常有效的蛋白质组学分离分析工具[7，9，10]。

本研究将Peptide IPG IEF分离分析技术运用于复杂生物样品——鼠肝组织蛋白表达谱研究。利用Peptide IPGIEF良好的预分离能力和LTQ Orbitrap质谱的高分辨能力，对大鼠肝脏组织全蛋白进行鉴定分析，同时也对其乙酰化修饰进行了鉴定。在大鼠鼠肝中共鉴定到2039个蛋白，其中鉴定到18个赖氨酸乙酰化修饰蛋白及18个赖氨基酸乙酰化修饰位点。在鉴定到的乙酰化蛋白中，包括4个新的乙酰化蛋白和8个新的乙酰化位点，这些结果也为乙酰化蛋白研究提供了重要数据基础和方法参考。 同时，本研究对样品分离富集，降低样品的复杂度，提高蛋白的上样量，为无合适抗体的蛋白质分析奠定基础。

2实验部分

2.1仪器与试剂

等电聚焦仪；Protean II垂直电泳仪（BioRad公司）；真空冷冻干燥机（德国Christ公司）；MilliQ超纯水系统（美国Millipore公司）；系统： Nano Aquity液相色谱（Waters公司），纳升级LC20AD（岛津公司）。LTQ Orbitrap质谱仪（Thermo Fisher公司）。Peptide captrap C18色谱捕集柱 （2 mm×0.5 mm， Michrom公司）；Magic C18 AQ分析柱 （100 μm×150 mm，5 μm ，Michrom公司）。

pH 310 NL 18 cm IPG胶条， Ampholyte （GE Healthcare）； Trypsin （Proteomics Sequencing Grade Modified， Sigma公司）；蛋白酶抑制剂（Protease inhibitor cocktail，Roche公司）；TSA（Tocris Bioscience公司）；烟酰胺（US Biological公司）；其余试剂为进口或国产试剂分装。色谱所用试剂均为HPLC级。

2.2实验方法

实验主要流程见图1： 首先提取鼠肝全蛋白，用胰蛋白酶进行溶液酶解，得到的酶解肽段用18 cm 的pH 3～10 NL IPG 胶条进行Peptide IPG IEF分离，分离完全后将胶条分割为18份，并用0.1%甲酸溶液分别提取肽段，提取的肽段溶液用LCMS/MS分离鉴定，最后将得到的蛋白进行数据分析。

摘要 利用肽段固相胶条等电聚焦技术对大鼠鼠肝组织蛋白质酶解产物进行预分离，反相色谱分离所得预分离组分后，用LTQOrbitrap MS进行分析。共鉴定到2039个蛋白质，包括18个乙酰化蛋白，其中4个乙酰化蛋白未被报道过。对这些蛋白进行了生物信息学分析。结果表明，将肽段等电聚焦与LCMS/MS结合起来，是一种有效的蛋白质组学分析技术，适合于大规模蛋白质鉴定分析。

关键词 固相等电聚焦； 液相色谱质谱联用； 鼠肝蛋白质

1引言

蛋白质的分离与鉴定是蛋白质组学研究的重要内容，但由于生物样品的复杂性，在进行蛋白鉴定分析前，往往需要预分离简化体系后再进行鉴定分析。蛋白质等电聚焦分离技术是一种有效的预分离方法，被用于蛋白质组学研究中，取得了很好的成果[1～5]。但蛋白质的液相等电聚焦在研究中存在一些问题，例如聚焦结束后需对分离的各组分蛋白质分别酶解，溶液中pH值不稳定，同时在线分析能力不强，所以科学家又发展了肽段固相等电聚焦的方法。

基于固相pH梯度（Immobilized pH gradients，IPG） 胶条的肽段等电聚焦分离技术（Peptide IPG IEF）是液相等电聚焦的重大发展。它利用传统的2 DE分离仪器，在IPG 胶条上对肽段进行等电聚焦分离。2008年，Hubner等[6]采用Peptide IPG IEF代替胶内酶解技术，将其引入蛋白质组学分析中。同年，Chick等[7]将Peptide IPGIEF与LCMS/MS联用，分析了鼠肝中的膜蛋白，他们通过此方法共发现了1549个非冗余膜蛋白。 2009年，McQuade等[8]将Peptide IPGIEF与LCMS/MS联用，分析了人类胚胎干细胞，这种技术提高了蛋白检测的覆盖率，是一种有效的蛋白质组学分析流程。 Peptide IPGIEF简便易行，上样量大（mg级），同时胶条上pH值稳定，并且对肽段的提取和后续处理非常简便，非常适合与LCMS/MS联用，是一种非常有效的蛋白质组学分离分析工具[7，9，10]。

本研究将Peptide IPG IEF分离分析技术运用于复杂生物样品——鼠肝组织蛋白表达谱研究。利用Peptide IPGIEF良好的预分离能力和LTQ Orbitrap质谱的高分辨能力，对大鼠肝脏组织全蛋白进行鉴定分析，同时也对其乙酰化修饰进行了鉴定。在大鼠鼠肝中共鉴定到2039个蛋白，其中鉴定到18个赖氨酸乙酰化修饰蛋白及18个赖氨基酸乙酰化修饰位点。在鉴定到的乙酰化蛋白中，包括4个新的乙酰化蛋白和8个新的乙酰化位点，这些结果也为乙酰化蛋白研究提供了重要数据基础和方法参考。 同时，本研究对样品分离富集，降低样品的复杂度，提高蛋白的上样量，为无合适抗体的蛋白质分析奠定基础。

2实验部分

2.1仪器与试剂

等电聚焦仪；Protean II垂直电泳仪（BioRad公司）；真空冷冻干燥机（德国Christ公司）；MilliQ超纯水系统（美国Millipore公司）；系统： Nano Aquity液相色谱（Waters公司），纳升级LC20AD（岛津公司）。LTQ Orbitrap质谱仪（Thermo Fisher公司）。Peptide captrap C18色谱捕集柱 （2 mm×0.5 mm， Michrom公司）；Magic C18 AQ分析柱 （100 μm×150 mm，5 μm ，Michrom公司）。

pH 310 NL 18 cm IPG胶条， Ampholyte （GE Healthcare）； Trypsin （Proteomics Sequencing Grade Modified， Sigma公司）；蛋白酶抑制剂（Protease inhibitor cocktail，Roche公司）；TSA（Tocris Bioscience公司）；烟酰胺（US Biological公司）；其余试剂为进口或国产试剂分装。色谱所用试剂均为HPLC级。

2.2实验方法

实验主要流程见图1： 首先提取鼠肝全蛋白，用胰蛋白酶进行溶液酶解，得到的酶解肽段用18 cm 的pH 3～10 NL IPG 胶条进行Peptide IPG IEF分离，分离完全后将胶条分割为18份，并用0.1%甲酸溶液分别提取肽段，提取的肽段溶液用LCMS/MS分离鉴定，最后将得到的蛋白进行数据分析。

摘要 利用肽段固相胶条等电聚焦技术对大鼠鼠肝组织蛋白质酶解产物进行预分离，反相色谱分离所得预分离组分后，用LTQOrbitrap MS进行分析。共鉴定到2039个蛋白质，包括18个乙酰化蛋白，其中4个乙酰化蛋白未被报道过。对这些蛋白进行了生物信息学分析。结果表明，将肽段等电聚焦与LCMS/MS结合起来，是一种有效的蛋白质组学分析技术，适合于大规模蛋白质鉴定分析。

关键词 固相等电聚焦； 液相色谱质谱联用； 鼠肝蛋白质

1引言

蛋白质的分离与鉴定是蛋白质组学研究的重要内容，但由于生物样品的复杂性，在进行蛋白鉴定分析前，往往需要预分离简化体系后再进行鉴定分析。蛋白质等电聚焦分离技术是一种有效的预分离方法，被用于蛋白质组学研究中，取得了很好的成果[1～5]。但蛋白质的液相等电聚焦在研究中存在一些问题，例如聚焦结束后需对分离的各组分蛋白质分别酶解，溶液中pH值不稳定，同时在线分析能力不强，所以科学家又发展了肽段固相等电聚焦的方法。

基于固相pH梯度（Immobilized pH gradients，IPG） 胶条的肽段等电聚焦分离技术（Peptide IPG IEF）是液相等电聚焦的重大发展。它利用传统的2 DE分离仪器，在IPG 胶条上对肽段进行等电聚焦分离。2008年，Hubner等[6]采用Peptide IPG IEF代替胶内酶解技术，将其引入蛋白质组学分析中。同年，Chick等[7]将Peptide IPGIEF与LCMS/MS联用，分析了鼠肝中的膜蛋白，他们通过此方法共发现了1549个非冗余膜蛋白。 2009年，McQuade等[8]将Peptide IPGIEF与LCMS/MS联用，分析了人类胚胎干细胞，这种技术提高了蛋白检测的覆盖率，是一种有效的蛋白质组学分析流程。 Peptide IPGIEF简便易行，上样量大（mg级），同时胶条上pH值稳定，并且对肽段的提取和后续处理非常简便，非常适合与LCMS/MS联用，是一种非常有效的蛋白质组学分离分析工具[7，9，10]。

本研究将Peptide IPG IEF分离分析技术运用于复杂生物样品——鼠肝组织蛋白表达谱研究。利用Peptide IPGIEF良好的预分离能力和LTQ Orbitrap质谱的高分辨能力，对大鼠肝脏组织全蛋白进行鉴定分析，同时也对其乙酰化修饰进行了鉴定。在大鼠鼠肝中共鉴定到2039个蛋白，其中鉴定到18个赖氨酸乙酰化修饰蛋白及18个赖氨基酸乙酰化修饰位点。在鉴定到的乙酰化蛋白中，包括4个新的乙酰化蛋白和8个新的乙酰化位点，这些结果也为乙酰化蛋白研究提供了重要数据基础和方法参考。 同时，本研究对样品分离富集，降低样品的复杂度，提高蛋白的上样量，为无合适抗体的蛋白质分析奠定基础。

2实验部分

2.1仪器与试剂

等电聚焦仪；Protean II垂直电泳仪（BioRad公司）；真空冷冻干燥机（德国Christ公司）；MilliQ超纯水系统（美国Millipore公司）；系统： Nano Aquity液相色谱（Waters公司），纳升级LC20AD（岛津公司）。LTQ Orbitrap质谱仪（Thermo Fisher公司）。Peptide captrap C18色谱捕集柱 （2 mm×0.5 mm， Michrom公司）；Magic C18 AQ分析柱 （100 μm×150 mm，5 μm ，Michrom公司）。

pH 310 NL 18 cm IPG胶条， Ampholyte （GE Healthcare）； Trypsin （Proteomics Sequencing Grade Modified， Sigma公司）；蛋白酶抑制剂（Protease inhibitor cocktail，Roche公司）；TSA（Tocris Bioscience公司）；烟酰胺（US Biological公司）；其余试剂为进口或国产试剂分装。色谱所用试剂均为HPLC级。

2.2实验方法

实验主要流程见图1： 首先提取鼠肝全蛋白，用胰蛋白酶进行溶液酶解，得到的酶解肽段用18 cm 的pH 3～10 NL IPG 胶条进行Peptide IPG IEF分离，分离完全后将胶条分割为18份，并用0.1%甲酸溶液分别提取肽段，提取的肽段溶液用LCMS/MS分离鉴定，最后将得到的蛋白进行数据分析。