不同嗜盐机制微生物蛋白质组特性及其识别

葛慧华，黄可君，张光亚

（华侨大学 化工学院，福建 厦门361021）

来源于嗜盐菌［1］的嗜盐酶（尤其是水解酶）能适应高浓度盐，也能忍受很宽的p H值，在医药、食品、纺织及化工产业等领域有广泛应用［2］.嗜盐微生物的嗜盐机理一直是研究者关注的焦点，目前已发现微生物主要通过两种方式对抗胞外的高盐环境［3-5］：1）在细胞内积累高浓度的K＋以对抗高渗环境（saltin）；2）在细胞内积累细胞相容性溶质来抗衡外界盐环境的负面影响（salt-out）.近年来，随着嗜盐微生物基因组和蛋白质组计划的完成，对第一种嗜盐机制微生物蛋白质组的分析日益增加［6］，而对后一种适应机制的微生物蛋白质组的研究则很少.由于细胞相容性物质都有带电荷的基团（如氨基酸来源的相容性物质），因此蛋白质为了在高浓度的细胞相容性物质中保持溶解性和稳定性，必须减少其分子表面非极性的面积［7-8］.这种微生物中蛋白质与其同源蛋白同样存在与嗜盐机制有关的差异，不过其差异程度相对较小［7］.生物信息学和比较蛋白质学的发展为研究嗜盐菌的机理提供了新思路，所得结果对设计新的嗜盐蛋白具有积极指导价值［9-10］.然而，多数方法并未对两种不同嗜盐机制的蛋白进行区分.本文选取了两株不同嗜盐机制的微生物及一株非嗜盐微生物的全蛋白质组序列，探讨了不同嗜盐蛋白稳定性机制，并使用一种新型核函数的支持向量机方法对3种蛋白进行了识别.

1 材料和方法

1.1 菌株选取及序列数据构建

根据以下3点规则从数据库选取微生物：1）必须是嗜盐微生物，且基因组注释已经完成，可提供大量蛋白质序列；2）所选取微生物最适生长温度接近，减少了温度对其氨基酸使用偏好的影响；3）微生物基因组的G＋C摩尔分数非常接近，最大程度减少了GC摩尔分数对氨基酸使用偏好的影响.所选取的嗜盐菌分别为Halobacteriumsp.NRC-1和Halomonaselongata，前一个为细胞内积累KCl（saltin）［11］，后一个为积累细胞相容性物质（salt-out）［12］，而非嗜盐菌为CaulobactercrescentusCB15［13］.这样，它们在氨基酸使用上的差异就主要是由嗜盐机制不同造成的.

使用Blastclust程序［14］共得到1 701，2 382及2 703条序列，其所占比例分别为25.1%，35.1%和39.8%.上述6 786条序列ID号，FASTA格式的序列，以及蛋白质长度等信息保存在一个基于Microsoft Access的数据库中.

1.2 氨基酸组成差异

考虑到蛋白质序列中20种氨基酸出现的频率存在较大差异，因此，在比较不同氨基酸组成差异的时候需要考虑这个因素，以使结果更能反映真实差异［15］.为此，统计了Uniprot数据库中所有蛋白序列氨基酸组成，并计算3种微生物中各蛋白质氨基酸组成.两种嗜盐蛋白Halobacteriumsp.NRC-1和Halomonaselongata分别表示为HIP和HOP，其与非嗜盐蛋白（表示为NP）氨基酸组成的差异为

式（1）～（2）中：Nj，I，Nj，O和Nj，N分别表示积累盐离子（salt-in）、细胞相容性物质（salt-out）及非嗜盐蛋白标准化的氨基酸组成；j表示20种氨基酸；Cj，I，Cj，O和Cj，N分别表示这3种蛋白中氨基酸组成；Cj，av表示Uniprot数据库所有序列氨基酸组成平均值.经计算，3种蛋白质组累计统计的氨基酸数量分别为525 159，805 826和896 556.

1.3 有效性检验

在评估模型优劣过程中，经常采用独立样本测试、交叉验证和Jackknife测试3种方法［16-17］.在实际操作过程中，该法运算速度较慢且消耗计算机资源庞大，因此，交叉验证被越来越多的研究者采用［18-20］，而它实际上是Jackknife测试的一个特例.文中采用10倍交叉验证（10-CV）.

1.4 识别效果评估

模型最终表现通过以下2个参数进行描述，预测准确率（γ）和受试者操作特性曲线下面积（A）.一般而言，分类器的A值大于0.9，则被认为优秀.文中实现所有算法的软件均来自于怀卡托智能分析环境（Weka 3-6-8）［21］，使用DELL precisionTM490工作站，所有运行参数均采用默认值.

2 结果与分析

2.1 两种嗜盐蛋白与非嗜盐蛋白氨基酸组成差异

经与非嗜盐蛋白比较，两种嗜盐与非嗜盐蛋白氨基酸组成存在较明显差，如图1（a）所示.为此，特定义在 HIP或 HOP中，若｜Dj，I-N｜＞0.25或｜Dj，O-N｜＞0.25，则氨基酸j视为显著性氨基酸.可见，在HIP中存在较多的Asp，Thr和Val，较少的Lys，Trp和 Met；而HOP中这种显著性氨基酸则明显较少，只有较多的His和较少的Ala.Asp作为一种酸性氨基酸在嗜盐蛋白（salt-in）中大量存在，这已得到广泛证实.Asp主要存在于蛋白分子表面，与阳离子（如K＋）相互作用，从而增加嗜盐蛋白的稳定性.此外，其分子中碱性氨基酸（如Lys）的含量则显著减少［22］.Thr由于侧链带有羟基，非常容易和环境中水分子形成氢键，有助于蛋白在高盐浓度中保持可溶性及结构和功能.Val具有一定疏水性，且分子较小，有利于保持嗜盐蛋白更紧凑的疏水核心，从而增加其稳定性［23］.Met是一种疏水性较强的氨基酸，而研究表明嗜盐蛋白稳定性与其较低的疏水性有关［24］，因此，Met在嗜盐蛋白中含量较低.Trp属于芳香族且疏水性较强，研究表明芳香族氨基酸在嗜盐蛋白中含量很少［25］.

对HOP（通过细胞相容性物质稳定的蛋白）而言，其与非嗜盐蛋白的氨基酸组成虽然也存在差异，但相比于HIP则明显较少.其中His较多而Ala则较少.Costantini等［26］认为，Ala非常容易形成α-螺旋，而His则具有很强的无规则卷曲形成趋向.众所周知，α-螺旋是一种较刚性的结构，而无规则卷曲则极具柔性，减少α-螺旋和增加无规则卷曲可增加蛋白质分子的柔性，而分子柔性与其功能密切相关［27］.这很可能有助于蛋白在细胞相容性物质浓度较高的细胞液中保持稳定.

为了进一步了解其差异，参考相关文献［28］把氨基酸分成14种类型，包括带电的（Ch），脂肪族（Al）、芳香族（Ar）、极性的（Po）、中性的（Ne）、疏水性的（Hy）、带正电（Ps）、带负电（Ng）、微小的（Ti）、小的（Sm）、大的（La）、含硫的（Su）、酰胺（Am）及酸性与碱性氨基酸（A-B）的差值.比较它们在 HIP及HOP与NP中的差异，结果如图1（b）所示.

由图1（b）可知：HIP中性氨基酸、微小的氨基酸及带电氨基酸明显较高，疏水性氨基酸则明显较少；而HOP中仅有较小的氨基酸明显多于非嗜盐蛋白.研究表明：中性氨基酸不与离子发生静电引力，其在高盐条件下很易形成疏水相互作用，而侧链微小或较小的氨基酸在蛋白质内核组装过程中更容易占据蛋白质分子中不同空间［29］.这对维持蛋白稳定性非常重要.

图1 嗜盐与非嗜盐蛋白氨基酸组成的差异Fig.1 Compositional differences of amino acids between halophilic and non-halophilic proteins

此外，HIP和HOP与NP中酸性氨基酸与碱性氨基酸差值均差异明显，尤其在HIP中.这与大多数研究所发现的嗜盐蛋白酸性氨基酸含量明显超过碱性氨基酸含量的结果吻合.然而，Bardavid等［30］的研究发现，在Halanaerobiales属中一些在细胞内积累高浓度KCl的嗜盐蛋白并不存在这种差异.

综上所述，对于HIP而言，文中结果与大多数文献报道结果相吻合，但通过引入所有蛋白平均氨基酸组成使其结果更为明显；而对HOP而言，其氨基酸组成差异虽然没有HIP与NP这么明显，但它们可能通过增加分子柔性及更高效的内核组装，来保持蛋白质在高细胞相容性物质环境中的可溶性、稳定性及行使正确的生物学功能.

2.2 基于PUKF的支持向量机识别精度

支持向量机（SVM）是生物信息学领域最常用的分类工具［31］，其分类性能主要取决与核函数，而核函数的选取及其对应参数的优化非常耗时.为此，采用一种通用核函数，通过参数调整，可适应各种数据［32-33］.文中选取Person通用核函数（PUKF）［32］，它在生物学领域尚不多见［34］.基于PUKF的支持向量机对两种嗜盐蛋白和两种嗜盐蛋白与非嗜盐蛋白的识别效果，如表1所示.

表1 不同算法的预测精度Tab.1 Performances of different algorithms

对两种嗜盐蛋白而言，10-倍交叉验证的结果表明：基于PUKF的支持向量机识别精度最佳，可达92.5%.其A值为0.921，大于0.9，说明该分类器的识别效果优秀.相比而言，其识别精度比单一分类器的径向基核函数（RBF）的支持向量机高7.1%，比组合分类器的Bagging（基础分类器为Decision Stump）高15.3%.此外，同其他几种核函数的支持向量机相比，其准确率分别高于RBF和线性核函数的7.1%和4.2%，与多项式核函数的支持向量机比较接近.然而，相对于后者，PUKF的支持向量运算所需时间明显较少，如完成本次运算，前者所需时间约6 min，而同样条件下的多项式支持向量机（E＝5）所需时间约14 min，是前者的2倍多.由此可见，PUKF的支持向量机能兼顾运算效率与运算精度.

同样，采用PUKF的支持向量对两种嗜盐蛋白与非嗜盐蛋白进行识别.对于这三种类型的蛋白，该方法的10-倍交叉验证验证的精度达到84.1%，其A值达到0.895，接近0.9，说明其识别精度依然令人满意.相对与其他单一分类器而言，其精度提高0.5%至10.2%不等；相比组合分类器，其识别精度有6.3%至32%的提高；相比其他几种常见核函数的支持向量机，其精度依然最佳，比RBF和线性核函数的支持向量机分别高出5.9%和8.5%；相比多项式核函数的支持向量机，也有0.5%至1.7%左右的提升，识别效果基本相当，但其运算效率则提升明显.因此，在本识别过程中，PUKF的支持向量机算法表现最好，而且其运算精度高、速度快，对计算机资源的消耗较少，在大规模数据分析方面更具优势.

此外，本方法对两种嗜盐及非嗜盐蛋白识别精度为84.1%，虽然未能达到预期的90%以上，但相比对这3种类型蛋白进行随机猜测的几率33.3%而言，其效果已明显提高了53.8%；而对两种嗜盐的识别精度达92.5%，相比于随机猜测的几率50%而言，其精度提高了42.5%.由此看来，对3种不同类型蛋白识别的精度还是令人满意的.

2.3 不同长度序列预测精度的差异

当使用氨基酸组成作为序列特征值时，识别精度随序列长度的变化而出现差异.这种现象在之前的相关研究中已有报道.如Grominha［35］在识别球状蛋白和外膜蛋白过程中发现，对少于300个氨基酸的蛋白而言，其识别精度为86%，对氨基酸数量在300～800之间的蛋白，其识别精度高达98%，而对大于800个氨基酸的蛋白，其精度为100%.Zhang等［36］对嗜热和常温蛋白的预测结果也表明，对小分子蛋白（少于200个氨基酸），其识别精度为仅为79%，而对大分子蛋白（大于800个氨基酸）的识别精度则达100%.然而，研究者并未对此现象进行过多的解释，其可能的原因也未作进一步探讨.

按照序列长度（L）将蛋白质序列分为4个类型，并进行自一致性检验，其平均识别精度为89.5%，不同长度蛋白质序列的识别精度分析结果，如表2所示.表2中：L为序列长度；n为序列数量；nc为正确预测的序列数量；φ为不同长度蛋白质序列数量的百分比；η为预测的准确率.从表2可知：随着蛋白质序列长度的增加，识别精度逐渐上升，对较小的蛋白分子，其识别精度为86.2%，比平均值低3.3%；对大分子蛋白，其识别精度达97.1%，比平均值高出7.6%；而对中等大小（200～800）的识别精度也均高于平均值.

表2 不同长度蛋白质序列的预测结果Tab.2 Prediction performances of different sequence lengths

3 结论

文中严格区分两种不同嗜盐机制的蛋白，并分别将其同非嗜盐微生物蛋白质组进行了比较.结果表明：对HIP而言，其结果与报道结果吻合，而对HOP而言，其分子中含有更多柔性的二级结构，同时分子中较小的氨基酸占多数，这在之前相关文献中未见报道.这对认知两种不同嗜盐机制蛋白稳定性的机制及对结构和功能强化的理性设计具有重要指导意义.

此外，从蛋白质类型而言，出现预测错误主要是HOP与NP之间，而从蛋白质大小而言，主要是对分子量小的蛋白预测精度偏低.因此，如何有效解决上述两个问题以提高识精度将是后续研究重点.

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