肿瘤相关长非编码RNA的表达及调控机制的研究进展

陈 葳，薛 梅

(西安交通大学医学院第一附属医院检验科，陕西西安 710061)

转录组学分析证实，哺乳动物基因组可转录出大量不编码蛋白质的非编码RNA(non-coding RNAs, ncRNAs)，这些ncRNAs可分为片段长度小于200 nts的短链非编码RNA和片段长度大于200 nts的长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNAs)[1]。起初，ncRNAs被认为是转录的“噪音”或者是RNA聚合酶Ⅱ的“副产物”，不具有生物学功能。但是，随着对ncRNAs的深入研究，发现ncRNAs也是具有调控功能的生物学分子[2]。目前，绝大多数ncRNAs的研究集中在短链非编码RNA，对其特性、分类、功能已阐明的较为清楚，其中microRNA可以调控mRNA表达；小核仁RNAs指导RNA分子的化学修饰；siRNAs参与RNA干涉通路；Piwi-RNAs与转座子的转录基因沉默有关[3-4]。

近期研究发现，lncRNAs也是具有重要生物学功能的调控分子，在调控基因表达和表观遗传学修饰方面发挥着重要作用[5]。许多复杂的人类疾病中都伴随着lncRNAs的表达失调，例如心血管疾病、阿尔茨海默病以及各种类型的肿瘤。然而，lncRNAs与肿瘤的关系是我们课题组一直关注并致力于研究的领域。有研究表明，一些lncRNAs与肿瘤类型相关，可作为肿瘤诊断的新分子标志物和治疗的新靶点[6]。但是，lncRNAs在人类肿瘤中特异性表达及其表达异常的分子机制尚不清楚。因此，本文仅对肿瘤相关性长非编码RNA的表达及调控机制进行了探讨。

1lncRNAs在肿瘤组织细胞中的表达

lncRNAs的表达具有组织细胞及发育时期的特异性。研究显示lncRNAs在组织中表达的特异性比蛋白编码基因要高。H19是第1个被发现的印迹lncRNA，它在食道癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌和转移性肝癌等组织中都异常表达[7]。肺腺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT-1)是在多种肿瘤中高表达的lncRNA，其表达异常与多种肿瘤发病相关，包括乳腺癌、肺癌和肝癌[8]。HOX基因的反义基因间RNA HOTAIR是在原发性和转移性乳腺癌中表达上调的lncRNA，而且HOTAIR在结肠癌组织中的表达也上调[9]。HULC(highly upregulated in liver cancer, HULC)是筛选肝细胞癌特异性cDNA文库后得到的，在肝细胞癌中异常高表达的lncRNA[10]。UCA1(urothelial carcinoma associated 1, UCA1)是在膀胱癌中特异性高表达的lncRNA，UCA1基因外源性表达可以促进膀胱癌细胞的增殖与迁移能力，产生对顺铂和丝裂霉素的耐药性[11-12]。PlncRNA-1是在前列腺癌中高表达的lncRNA，沉默PlncRNA-1可显著降低前列腺癌细胞的增殖，诱导细胞的凋亡[13]。BRUNNER等人[14]利用3′末端测序的技术分析了17种肿瘤组织样本和相对应的正常组织样本，发现1 065个已知的lncRNAs和1 071个新的基因间lncRNAs在样本中的表达具有差异性，并且发现了lncRNA Peak 13 741在雌激素受体阳性和阴性的乳腺癌中表达具有显著的差异。以上这些研究数据表明lncRNAs的表达具有组织特异性，并且许多lncRNAs是肿瘤特异性表达，提示这些lncRNAs可能会成为肿瘤诊断和预后监测的分子标志物。

lncRNAs的表达除了具有组织特异性外，其在细胞中的定位也具有特异性。与mRNA和其他ncRNAs不同，lncRNAs在细胞中主要定位于细胞核，但也有部分lncRNAs分布于细胞质中。VIDISHA等人利用RNA原位杂交技术检测发现MALAT-1主要定位于细胞核中speckles结构域。Speckles是高度动态的亚核结构域，是负责对mRNA前体进行剪切的剪切复合体驻留和发生修饰的地方。研究还发现MALAT-1可以与剪切因子家族SerArg剪接因子相互作用，调节这些因子分布至speckles。由此认为，MALAT-1通过控制SerArg剪接因子的磷酸化水平从而调控mRNA前体的选择性剪接[15]。lncRNAs在细胞中的定位不同，赋予了lncRNAs的不同的生物学功能；定位于细胞核的lncRNAs可作为microRNA的前体，其调控相应的microRNA从而发挥重要的生物学功能。研究发现，H19是同时分布在细胞核和细胞质中的lncRNA，H19的1号外显子是miR-675-5p和miR-675-3p的模板，这两个microRNA赋予了H19相应的生物功能[16]。而对于定位在细胞质的lncRNAs，则是具有功能活性的成熟的lncRNAs。肝癌中高表达的lncRNA HULC的RNA主要定位在肝癌细胞胞质中，其可作为分子海绵或分子诱饵降低miR-372的表达与活性[17]。有关lncRNAs在细胞中特异性的分布与定位的研究，对于今后研究lncRNAs的功能具有重要的提示意义。

2lncRNAs表达与肿瘤侵袭转移及预后的关系

lncRNAs表达不但具有组织细胞的特异性，而且lncRNAs的表达与肿瘤侵袭转移及预后密切相关。HOTAIR在原发性乳腺癌和转移性乳腺癌中的表达都会增加，并且原发肿瘤中HOTAIR的表达水平可以用来有效预测乳腺癌的转移和预后[18]。MALAT-1在非小细胞肺癌高转移肿瘤中的表达明显高于非转移肿瘤，沉默MALAT-1的表达将阻止肺腺癌细胞的迁移。MALAT-1除了在肺癌中高表达外在其他类型的肿瘤中该分子也高度过表达。MALAT-1高表达可增加肝癌的复发率，细胞学实验发现MALAT-1表达抑制能有效降低细胞侵袭迁移能力，MALAT-1表达抑制还可以有效减少宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力。因此，MALAT-1可作为多种肿瘤侵袭迁移及预后诊断的一个重要分子生物学标志物[19]。HULC不仅在肝细胞癌中高表达，而且在结直肠癌肝转移瘤中其表达也上调。但是，HULC在原发性结直肠癌和非肝转移瘤中则不表达[20]。UCA1在膀胱癌中表达阳性率高达100%，其表达在膀胱癌不同病理分级、分期以及原发和复发膀胱癌组织中均具有统计学意义，细胞学实验发现UCA1基因外源性表达可以促进膀胱癌细胞的侵袭与迁移能力。因此，UCA1有望成为膀胱癌侵袭转移诊断的核酸分子标志物[21]。lncRNAs表达与肿瘤侵袭转移及预后的研究，将为肿瘤临床诊断与治疗提供更多有效的核酸分子标志物及治疗靶点。

3lncRNAs的表达调控

3.1转录调节蛋白对lncRNAs表达的调控lncRNAs的表达主要依赖于转录水平的调控。GUTTMAN等人研究发现，人类21和22号染色体上存在Sp1、c-Myc和p53的结合位点，这些结合位点约有22%分布在蛋白编码基因的5′端，36%分布在蛋白编码基因的中部或3′端，并且这36%的转录因子结合位点与基因组中非编码RNA的分布一致。提示人类基因组中，非编码基因与编码基因的转录调控类似，都受到常见的转录因子所调控[22]。随后GUTTMAN等人在研究胚胎干细胞中lncRNAs表达时，发现位于基因间的lncRNAs linc2048可以被胚胎干细胞相关转录因子所调控，并且根据实验数据建立了一个lncRNAs功能研究的模型。在这一模型中，特定的转录因子可以调控lncRNAs的表达[23]。此外，YANG等人将6个物种不同组织细胞543个染色质免疫共沉淀-序列分析技术(chromatin immunoprecipitation-sequencing, ChIP-Seq)实验的数据整合建立了一个ChIPBase的数据库，该数据库是目前第1个提供lncRNAs转录调控图谱的数据库，通过对数百万个转录因子进行分析，最终确定约几万个转录因子与lncRNAs存在转录调控的关系[24]。

lncRNAs转录调控的研究发现，lncRNAs的启动子可以和转录因子Oct3/4、Nanog、CREB、Sp1、 c-Myc、Sox2、NF-κB和p53等结合并且受这些转录因子所调控[25-26]。KOSHIMIZU等[27]采用染色质免疫共沉淀结合基因芯片技术发现，神经母细胞瘤细胞株中MALAT-1启动子区有转录因子CREB的结合位点。WANG等[17]研究发现，肝细胞癌中HULC的核心启动子区中存在CREB的结合位点，并且证实PKA通路可能参与HULC的上调，HULC作为分子海绵或分子诱饵与miR-372特异性结合，从而降低miR-372的表达与活性。抑癌基因p53可作为转录激活因子调节多种lncRNAs的表达，p53可以下调印迹lncRNA H19的表达。p53通过与多种lncRNAs启动子的p53结合模体相互作用并以p53依赖的方式调节这些lncRNAs的转录，而且p53激活的lncRNA lincRNA-p21在p53通路中可作为转录抑制子调控细胞凋亡[28]。我们研究发现，UCA1的核心启动子区有c-Ets-2和C-EBPα的结合位点，并且c-Ets-2和C-EBPα作为正向的转录调控因子参与调控UCA1基因的转录水平及启动子活性(数据未发表)。有关转录调节蛋白对lncRNAs基因表达调控的研究，表明lncRNAs和蛋白编码基因类似都受到常见的转录调节蛋白所调控。但是，lncRNAs转录调控机制的研究尚处于起步阶段，研究者期望通过针对性的干预lncRNAs启动子与转录因子的结合，逆转lncRNAs在肿瘤中的异常表达，从而达到肿瘤靶向治疗的目的。

3.2表观遗传学修饰对lncRNAs表达的调控SATISH等人[29]观察了不同细胞组织中DNA甲基化与组蛋白修饰标志物(H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3和H3K36me3)和lncRNAs转录起始位点(transcription start site, TSS)的相关性，研究发现无论lncRNAs基因的表达情况如何，其在TSS附近的甲基化密度都比蛋白编码基因高。组蛋白修饰标志物H3K4me3、H3K36me3、H3K27me3与lncRNAs表达相关，其作用方式与mRNA的调控相类似。因此，lncRNAs表观遗传学调控与mRNA的表观遗传学调控具有相似的特性。

MEG3是第1个被发现具有肿瘤抑制功能的印迹lncRNA[30]。研究发现MEG3的表达受到表观遗传学的控制。在许多肿瘤中MEG3都存在表达缺失，导致MEG3在肿瘤中表达缺失的机制包括基因删除、启动子超甲基化和基因间差异性甲基化区域的超甲基化。MEG3上游有2个差异性甲基化区域(differentially methylated region, DMR)，其覆盖了MEG3第1外显子上游1.5 kb，并且延伸到第1个内含子，其中MEG3启动子也是MEG3-DMR覆盖的区域并且GC含量丰富。值得注意的是在MEG3启动子存在cAMP反应元件(CRE)的结合位点，删除这一结合位点能明显降低启动子转录活性。除此之外，CRE序列包含一个CpG岛，表明这一CpG的甲基化可能阻止转录因子与此位点的结合，这可能在肿瘤中MEG3基因启动子沉默中发挥作用[31]。MEG3启动子的甲基化还可以受到microRNA的调控，miR-29可以通过调节甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT), 使MEG3启动子甲基化，当过表达miR-29时可明显增加MEG3的表达，因此miR-29以甲基化依赖的方式调节MEG3的表达[32]。由此我们认为，lncRNAs表观遗传学的调控可能也是导致lncRNAs在肿瘤组织中表达异常的机制之一，而且这种调控作用与肿瘤的发生、发展密切相关。

4展望

随着人们对肿瘤特异性表达lncRNAs在肿瘤发生发展中作用的认识，研究者已经着手研发以lncRNAs为靶点的新药。针对性的干预lncRNAs的转录，逆转lncRNAs在肿瘤中的异常表达，以此达到肿瘤靶向治疗的目的。目前，对lncRNAs表达分子机制的研究还相当有限。因此，今后lncRNAs研究将可能集中于研究其表达调控，从而促使lncRNAs尽快成为临床肿瘤治疗的理想靶点。

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