HPLC-DAD-MS法定量分析黄芩中3种黄酮类化合物

徐杨璐璐，赵胜男，申川川，李守拙

(河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，河北承德 067000)

基础医学

HPLC-DAD-MS法定量分析黄芩中3种黄酮类化合物

徐杨璐璐，赵胜男，申川川，李守拙△

(河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，河北承德 067000)

目的:分析比较高效液相色谱-二极管阵列检测器-质谱(HPLC-DAD-MS)法和高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)法检测黄芩中3种黄酮类化合物的结果。方法:分别采用HPLC-DAD-MS法和HPLC-DAD法检测黄芩中3种黄酮类化合物黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素的含量。结果:HPLC-DAD-MS法测得黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素的含量分别比HPLC-DAD法平均少6.61%、73.98%和10.90%，其中汉黄芩苷的含量相差较大。结论:与HPLC-DAD法相比，HPLC-DAD-MS法含量测定结果更准确，且操作简便、重现性好，可用于黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素的含量测定。

黄芩;高效液相色谱-二极管阵列检测器-质谱法;质量控制

黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，性苦味寒，具有清热燥湿、凉血止血，安胎等功效[1]。近年来，有关黄芩中黄酮类化合物含量测定的方法主要有高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)法和高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)法[2-3]。由于中药材和中药制剂中通常含有大量的次生代谢产物，且其结构往往具有一定的相似性，很难获得良好的分离，因此，高效液相色谱法测定成分含量有一定的局限性[4-5]。高效液相色谱-二极管阵列检测器-质谱(HPLC-DADMS)法进行含量测定时通常采用多反应监测(MRM)模式，能有效排除存在于提取物中非目标化合物的干扰，提高含量测定结果的准确性。本研究采用HPLC-DAD-MS法测定了黄芩药材中黄芩苷、汉黄芩苷和汉黄芩素的含量，并与HPLC-DAD法含量测定结果进行了比较。

1 仪器与试药

Agilent 1100 Series高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，6310质谱仪(安捷伦公司);Mettler AG245电子分析天平(梅特勒-托利多有限公司)。黄芩，采自内蒙古赤峰，由中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室周世良研究员鉴定为正品黄芩。对照品黄芩苷(批号715-9506)、汉黄芩素(批号111514-200403)，中国药品生物制品检定所;汉黄芩苷(批号20090319)，上海顺勃生物工程技术有限公司。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 取黄芩粉末0.25g，置圆底烧瓶中，精密吸取溶剂(水:乙醇:乙酸乙酯:冰醋酸50:49:5:1)25ml，加热回流90min，静置，12000r/min离心10min，取上清液过0.45μm微孔滤膜，即为供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素对照品适量，甲醇溶解，制得黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素浓度分别为288、40.5、25μg/ml的混合对照品溶液。

2.3 色谱-质谱条件

2.3.1 色谱条件:色谱柱:Agilent Zorbax XDB-C18柱(2.1mm×150mm，3.5μm);流速0.2ml/min;柱温25℃;进样量2μl;检测波长276nm;流动相:0.1%甲酸-水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱，洗脱程序(0-10min，18%-20% B;10-18min，20%-25% B;18-30min，25%-30% B;30-40min，30%-40% B;40-60min，40%-60% B)。

2.3.2 质谱条件:采用电喷雾离子源正离子模式，多反应监测模式采集数据;电喷雾电压3500V，雾化气体为氮气，雾化气压力25psi;干燥气体为氮气，干燥气体积流量10L/min;离子源温度350℃;碰撞气体为高纯氦气。3种化合物的定量离子对分别是:黄芩苷447/271、汉黄芩苷461/285、汉黄芩素285/270。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线的制备:取混合对照品溶液，按2.3的条件测定，以对照品浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归，结果见表1:

表1 3种化合物的线性范围(n=3)

2.4.2 精密度试验:精密称定黄芩药材粉末0.25g，按2.1的方法制备供试品溶液，10倍稀释后按2.3的色谱-质谱条件连续进样6次，得黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素峰面积的RSD分别为0.95%、1.1%、1.5%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验:精密称取黄芩药材粉末0.25g，按2.1的方法制备供试品溶液，10倍稀释后按2.3的色谱-质谱条件分别于0、4、8、12和24h进样测定。得黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素峰面积的RSD分别为2.2%、2.6%、1.4%，表明供试品溶液室温放置24h稳定。

2.4.4 重复性试验:按2.1的方法平行制备6份供试品溶液，10倍稀释后按2.3的色谱-质谱条件进样测定，得黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素的RSD分别为0.92%、1.2%、1.5%，表明方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验:取9份已知含量的黄芩药材粉末0.125g，分别加入混合对照品溶液，按2.1的方法制备供试品溶液，10倍稀释后按2.3的色谱-质谱条件进样分析，计算加样回收率。结果见表2:

表2 黄芩药材中3种成分加样回收率试验结果(n=3)

2.5 样品含量测定 取10批黄芩药材，按2.1的方法制备供试品溶液，10倍稀释后进行HPLC-DAD-MS分析，每批重复测定3次，按照标准曲线方程计算3种成分的含量，并根据稀释倍数换算成黄芩药材中的含量，结果见表3:HPLC-DAD-MS法测得的黄芩药材中黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素的含量分别比HPLC-DAD法平均少6.61%、73.98%、10.90%。

表3 两种方法测得黄芩药材中3种成分的含量(mg/g，n=3)

3 讨论

2010版中国药典中依然采用高效液相色谱法对中药中的成分进行含量测定，但在该方法的使用过程中发现，如果光谱是一致的，峰仍可能包含不纯物。如果光谱吸收相对于主化合物很小，或不纯物和主化合物具有相同或几乎相同的光谱以及相近的洗脱时间也可能出现上述情况。

本研究对HPLC-DAD法和HPLC-DAD-MS法检测黄芩中黄酮类成分的结果进行了比较，结果显示，使用HPLC-DAD-MS法含量测定结果与HPLC-DAD法相比，黄芩苷和汉黄芩素的含量测定结果相差不大，汉黄芩苷的含量测定结果相差较大。本研究结果表明，使用HPLC-DAD法得到的3种成分的含量测定结果不尽准确。因此，建议药典应采用液质联用方法制定黄芩药材的质量标准，并将该方法应用于其它中药材的质量控制，进一步完善中药的质量标准。

[1]中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社，2010.282-283.

[2]熊春媚，郭亚东，马银海，等.RP-HPLC法测定黄芩苷和黄芩素的含量[J].食品与药品，2007，9(03A):15-17.

[3]潘鹏飞，孙菲，李延雪，等.HPLC法同时测定黄芩中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量[J].中国药师，2012，15(1):75-77.

[4]宁宇杉，曾顺泽，彭果，等.LC-MS/MS法测定藏药十三味红花丸中羟基红花黄色素A的含量[J].中国药房，2012，23 (27):2538-2540.

[5]刘荣霞，果德安，叶敏，等.液质联用技术(LC/MS)在中药现代研究中的应用[J].世界科学技术-中医药现代化，2005，7(5):33-40.

ANALYSIS OF THREE FLAVONOIDS IN SCUTELLARIA BAICALENSIS GEORGI BY HPLC-DAD-MS

XU Yang-lu, ZHAO Sheng-nan, SHEN Chuan-chuan, et al
(Hebei Key Laboratory of Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To compare the determination of three fl avonoids in Scutellaria baicalensis Georgi by high performance liquid chromatography with diode array detection and mass spectrometer (HPLC-DAD-MS) and high performance liquid chromatography with diode array detection (HPLC-DAD).Methods:HPLC-DAD-MS and HPLCDAD were respectively applied to determine Baicalin, Wogonoside and Wogonin in Scutellaria baicalensis Georgi.Results:The content of Baicalin, Wogonoside, Wogonin by HPLC-DAD-MS were 6.61%, 73.98% and 10.90% less than HPLC-DAD. Among them, the difference of Wogonoside content was fairly larger.Conclusions:Compared with HPLCDAD, HPLC-DAD-MS is more accurate, simple and convenient. So HPLC-DAD-MS can be used for the determination of Baicalin, Wogonoside, Wogonin in Scutellaria baicalensis Georgi.

Scutellaria baicalensis Georgi; HPLC-DAD-MS; Quality control

R284.1

A

1004-6879(2014)06-0461-03

△ 通讯作者

2014-04-19)