槐花蛋白萃取与营养评价的研究

马利华，秦卫东，陈学红，朱蒙蒙

（徐州工程学院食品学院，江苏徐州221008）

槐花蛋白萃取与营养评价的研究

马利华，秦卫东*，陈学红，朱蒙蒙

（徐州工程学院食品学院，江苏徐州221008）

采用响应面对双水相体系萃取槐花蛋白进行优化，并对其进行营养评价。考察了PEG4000质量分数、（NH4）2SO4质量分数、pH、萃取温度等因素对槐花蛋白萃取率的影响，采用氨基酸自动分析仪进行营养分析评价。结果表明：最佳萃取条件为PEG4000的质量分数28%、（NH4）2SO4质量分数45%、pH5、萃取温度50℃，槐花蛋白中必需氨基酸比例比较均衡，符合WHO/FAO的推荐标准，有较高的营养价值，极具开发利用价值。

槐花，蛋白质，双水相体系，营养评价

槐花是豆科植物槐（Sophora japonica L.）的花朵或花蕾[1]，含有丰富的蛋白质、脂肪、糖、多种维生素，其中蛋白质可与牛、羊肝、苦杏仁相媲美[2]。有研究表明，槐花具有清热解毒、凉血润肺、降血压等功效[3-4]，许多食品工作者致力于对槐花中各种生物活性物质的研究。

双水相萃取体系是由两种互不相溶的高分子溶液或者互不相溶的盐溶液和高分子溶液组成，聚乙二醇（PEG4000）与（NH4）2SO4形成的双水相体系中，当PEG的浓度大于其成相临界点的浓度时，系统远离临界点，两相性质的差别增大，蛋白质在两相中的界面张力差别增大，使其趋于向一侧分配，具有能耗较低，分离步骤少，不会引起生物活性物质失活或变性，不存在有机溶剂残留等优点[5]，近年来有一些相关研究报道，如张喜峰等[6]采用双水相体系萃取分离葡萄酒下脚料中葡萄皮蛋白质，苏艳玲[7]采用PEG/（NH4）2SO4双水相体系萃取杏鲍菇多糖，孙亚莉等[8]采用双水相萃取红豆蛋白质等。以槐花为原料，双水相法萃取蛋白质的研究国内还未见报道。

本实验以干槐花为原料，采用PEG/（NH4）2SO4双水相体系，研究不同条件下萃取率，采用Box-Benhnken设计对双水相萃取槐花蛋白质条件进行优化，并对其进行营养分析，为槐花中蛋白质的高效充分提取，促进槐花蛋白功能食品加工可持续发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干槐花 市售；PEG4000、（NH4）2SO4、考马斯亮蓝G-250、磷酸、茚三酮 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；牛血清白蛋白、氨基酸标准品 生化试剂，AIGMA。

分液漏斗 上海玻璃仪器有限公司；FZ101微型植物粉粹机 济南翔科实验仪器有限公司；723型可见分光光度计 上海精宏实验设备有限公司；L-8800型氨基酸自动分析仪 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 双水相萃取单因素实验

1.2.1.1（NH4）2SO4质量分数和PEG4000质量分数对萃取效果的影响 分别取PEG4000质量分数为22%、24%、26%、28%、30%、32%和（NH4）2SO4质量分数为45%的两种溶液于小烧杯中，在pH 5、温度50℃的条件下混匀分层，取0.5g的槐花粉末加入混匀分层的溶液中，搅拌均匀，萃取0.5h，抽滤，滤液倒入量筒中，静置[9]，达到两相分离。

分别取（NH4）2SO4质量分数为30%、35%、40%、45%、55%和PEG4000质量分数为28%的两种溶液置于小烧杯中，在pH5、温度50℃的条件下混匀分层，取0.5g的槐花粉末加入混匀分层的溶液中，搅拌均匀，萃取0.5h，抽滤，滤液倒入量筒中，静置[9]，达到两相分离。

1.2.1.2 pH对萃取效果的影响 取PEG4000质量分数为28%和（NH4）2SO4质量分数为45%的两种溶液置于小烧杯中，分别在pH 3、4、5、6、7、8，温度50℃的条件下混匀分层，取0.5g的槐花粉末加入混匀分层的溶液中，搅拌均匀，萃取0.5h，抽滤，滤液倒入量筒中，静置[9]，达到两相分离。

1.2.1.3 温度对萃取效果的影响 PEG4000质量分数对萃取效果的影响取PEG4000质量分数为28%和（NH4）2SO4质量分数为45%两种溶液于小烧杯中，在pH 5、温度分别在30、40、50、60、70、80℃的条件下混匀分层，取0.5g的槐花粉末加入混匀分层的溶液中，搅拌均匀，萃取0.5h，抽滤，滤液倒入量筒中，静置[9]，达到两相分离。

1.2.1.4 萃取率计算 在PEG-（NH4）2SO4双水相体系中，（NH4）2SO4浓度的增高会使下相盐析作用加强，下相中的槐花蛋白向上相转移，并富集于上相，分别测定上下相蛋白质浓度，计算分配系数K及蛋白质萃取率Y。计算公式如下：

式中，Vt、Vb上、下相体积；Ct、Cb为上、下相蛋白质浓度（mg/m L）。

1.2.2 双水相萃取中心组合实验 根据采用Box-Behnken中心组合设计原理，以萃取率为考察指标，采用PEG4000质量分数、（NH4）2SO4质量分数、pH和温度四因素三水平进行响应面优选工艺。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Factorsand levelsof response surfacemethodology table

1.2.3 蛋白质测定 采用考马斯亮蓝法[10]，以牛血清白蛋白为标准蛋白，得到标准曲线方程为y=0.0069x+ 0.015，相关系数R2=0.9981。

1.2.4 蛋白质醇析 分离上相溶液，加入4倍体积的95%乙醇，静置，弃去上层溶液，沉淀物4000r/m in离心10m in，沉淀物冷冻干燥，得到槐花蛋白。

1.2.5 氨基酸组成 参照GB/T 5009.124-2003食品中氨基酸的测定[11]。取干燥后的槐花蛋白粉碎过60目筛，准确称取均匀性好的试样0.5g，置于水解管中，加盐酸溶液（6moL/L）10～15m L，然后反复充入高纯氮气，在充氮气状态下封口，置于110℃的恒温干燥箱内，水解22h后，冷却。将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗，定容至100m L，溶液经0.22μm滤膜过滤后装进样瓶，直接上氨基酸分析仪进行分析。

测定条件HITACHI L-8800全自动高速氨基酸分析仪，W indows NT操作系统，阳离子交换树脂分析柱3μm×4.6mm×60mm，测定波长570、440nm，分析时间为40m in，pH 2.2柠檬酸缓冲液流量0.4m L/m in，茚三酮流量0.3m L/m in，样品进样量为10μL。

数据处理：使用PASW Statistics 18.0软件进行数据处理，对样品氨基酸组成及含量进行分析和聚类分析。

1.2.6 氨基酸评分（Am inoaeidseore，AAS） 氨基酸评分为实验蛋白质中某一必需氨基酸占WFO/FAO评分模式中相应氨基酸含量的百分比[12]。

式中：x—实验蛋白质某一必需氨基酸含量；s—WHO/FAO评分模式氨基酸含量。

1.2.7 化学评分（Chem iealseore，CS） 化学评分是采用FAO1970推荐的方法[13]，测定评价待测蛋白质中某一必需氨基酸的相对含量（与其必需氨基酸总量之比）与标准鸡蛋白中相应必需氨基酸相对含量的接近程度，按下式计算：

式中：Ax待测蛋白质中某一必需氨基酸的含量；Ae待测蛋白质中必需氨基酸的总含量；Ex—标准鸡蛋白中相应必需氨基酸的含量；Ee—标准鸡蛋白中必需氨基酸的总含量。

1.2.8 数据处理 所有实验数据，均用Origin（V8.5.1）数据分析软件处理。

2 结果与分析

2.1 PEG4000质量分数对萃取效果的影响

实验结果表明，PEG4000浓度从22%上升至28%，槐花中上相蛋白质的萃取率不断的增加，当PEG4000质量分数为28%时，出现最大萃取率75.56%。说明当成相的两种物质的浓度很大的时候，成相的两种物质分子之间的作用力将会增强，且体系的表面的张力将会增强，从而致使溶液中的溶质会吸附在界面上，且溶液中的溶质在两相之间的传递及在两相中的扩散的阻力也会有很大程度的增强，从而目标蛋白分子不易于进入盐相；另一个方面，PEG4000浓度过大，黏度增大，阻止相间分子转移的能力增加，相界面张力也增加，因而分相的时间也就越会延长[14]。这与冯自立等的研究相同[15]。

2.2 （NH4）2SO4质量分数对萃取效果的影响

无机盐的浓度影响蛋白质的亲疏水性和蛋白质分子间的相互作用，从而影响蛋白质在双水相中的分配。（NH4）2SO4用量不同，上下相电位差不同，而电位差的大小直接影响到分配系数和萃取率[15]。图2显示，随着（NH4）2SO4质量分数的增加，蛋白质的萃取率随之增加，当（NH4）2SO4质量分数增加到45%（NH4）2SO4的饱和溶解度时，出现最大上相萃取率82.04%。

图1 PEG4000质量分数对槐花蛋白萃取率的影响Fig.1 Effect on extraction yield of Sophora japonica L.by different PEG4000massfraction

图2 （NH4）2SO4质量分数槐花蛋白萃取率的影响Fig.2 Effecton extraction yield of Sophora japonica L.by different（NH4）2SO4massfraction

2.3 pH对萃取效果的影响

在双水相系统中，由于体系的pH变化能明显地改变两相的电位差，而且pH的改变还导致蛋白质带电性质的变化，即影响蛋白质分子可离解基团的离解度，从而改变蛋白质的表面电荷数来影响分配。如体系pH与蛋白质的等电点相差越大，蛋白质在两相中分配越不均匀，pH的微小变化甚至可能使蛋白质分子的分配系数改变2～3个数量级[16]。由图3可知，在固定其他条件不变，pH为3～8范围内，槐花蛋白萃取率随pH的增大先增大后减小，在体系自身pH为5时达最大值84.05%。

图3 pH对蛋白质萃取效果的影响Fig.3 Effecton extraction yield of Sophora japonica L.by different pH

2.4 温度对萃取效果的影响

温度的变化影响物质的成相浓度，影响其分配。实验表明，随着温度的升高，槐花蛋白的萃取率逐渐增加，这是由于溶液温度上升后，分子运动加强，削弱了静电排斥作用的影响，导致槐花蛋白项上相移动，萃取率增加。当温度大于50℃之后，萃取率随温度的升高而逐渐减小，出现这种现象的原因是由于高温引起蛋白质部分失活，使槐花蛋白的萃取率减小。

图4 温度对槐花蛋白萃取效果的影响Fig.4 Effecton extraction yield of Sophora japonica L.by different temperature

2.5 双水相萃取Box-Behnken实验设计及结果

按照Box-Behnken实验设计的统计学要求，对实验进行回归拟合，实验设计及结果见表2。利用Design Expert软件，通过对表2中的数据进行分析，二次多项回归方程为：Y=86.22-0.28A-2.48B+2.65C-1.06D-1.13AB+0.91AC-1.64AD+3.40BC-1.75BD+ 1.88CD-0.081A2-3.92B2-7.49C2-1.61D2，该方法的方差分析及显著性检验见表3。

图5 （NH4）2SO4质量分数、pH交互对萃取效果影响的响应面Fig.5 Response surface for effected of（NH4）2SO4massfraction，pH

由表3方差分析结果可以看出，本实验所选用的二次多项模型极显著（p＜0.001），且方程失拟项不显著（p=0.1618＞0.1），说明各因素值与响应值之间的关系可以用此模型来函数化。相关系数R2=0.9326，校正决定系数R2adj=0.8648表明萃取率的预测值与实际值之间具有较好的拟合度。各因素中（NH4）2SO4质量分数（B）、pH（C）对实验结果有极显著影响，且交互作用也有较显著的影响，说明（NH4）2SO4质量分数和pH是槐花蛋白萃取实验中重要的控制因素，当PEG4000的质量分数28%、温度为50℃时，其交互作用的响应曲面见图5。

表2 Box-Behnken实验结果Tabe 2 Box-Behnken experiment results

由二次多项回归方程得到最佳萃取条件为：PEG4000的质量分数28%、（NH4）2SO4质量分数45%、pH 5、温度50℃，萃取率达到理论最大值87.52%。采用上述优化后的萃取条件对响应面法进行验证，共进行三次重复实验测得槐花蛋白质平均萃取率为86.68%，相对标准偏差为1.04%，说明采用响应面法优化得到的螯合工艺条件参数准确可靠，按照建立的模型进行预测实际中是可行的。

2.6 槐花蛋白的营养评价

食品中蛋白质、氨基酸种类和含量不一，其营养价值优劣主要取决于：a.是所含必需氨基酸的种类是否齐全；b.必需氨基酸数量的多少；c.各种必需氨基酸的组成比例[12]。氨基酸比值系数法给出了食品中必需氨基酸参考模式谱[13]。以人体各种必需氨基酸的比例作参考，食物蛋白质的氨基酸组成越接近人体蛋白质组成，并为人体消化吸收时，其营养价值越高。

表3 方差分析结果Tabe 3 Results of variance analysis

表4 槐花蛋白中氨基酸组成及含量Tabe 4 Composition and contents of amino acids in protein from Sophora japonica L.

表5 槐花蛋白中必需氨基酸含量及评分Tabe 5 Amino acid scores（AAS）and chemical scores（CS）in protein from Sophora japonica L.

由表4和表5可知，槐花中的氨基酸的含量非常丰富，种类齐全。必需氨基酸占总氨基酸的比值为34.24%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为52%。根据FAO/WHO的理想模式，质量比较好的蛋白质其氨基酸组成EAA/TAA为40%左右，EAA/NEAA为60%以上。由此可见，槐花蛋白中氨基酸组成略低于FAO/ WHO的理想模式，质量较佳。从评分来看，根据氨基酸评分，槐花蛋白中Lys仅为80，为第一限制性氨基酸，苯丙氨酸和酪氨酸含量较高，其他接近FAO/WHO计分模式，说明槐花蛋白中必需氨基酸含量基本符合FAO/WHO模式，是一种优良的植物蛋白源。

3 结论

由于双水相萃取分离过程条件温和、可调节因素多、易于放大和操作，是一种高效而温和的生物分离技术。本实验借助PEG/（NH4）2SO4双水相体系萃取干槐花中蛋白质，并对其进行氨基酸组成分析。结果表明，最佳提取条件为：PEG4000的质量分数28%、（NH4）2SO4质量分数45%、pH 5、温度50℃，槐花蛋白质平均萃取率为86.68%。经过分析得出，槐花蛋白中氨基酸组成基本符合FAO/WHO的理想模式，质量较佳，是一种优良的植物蛋白源，具有较高的开发价值。

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Study on extracted and nutritionalevaluation of protein from Sophora japonica L.

MA Li-hua，QINW ei-dong*，CHEN Xue-hong，ZHU M eng-meng
（College of Food Engineering，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221008，China）

Response surface methodology（RSM）was used for op tim izating the extracting cond itions of p rotein from Sophora japonica L.in the p rocess of aqueose two-phase system s，and the nutritional value was evaluated.The d ifferent influencing fac tor were stud ied as PEG/（NH4）2SO4massfraction，pH，temperature，the nutritional evaluation was used by automatic am ino acid analyzer.The results showed that the op tim izating extracting conditions were 28%PEG4000，45% （NH4）2SO4，pH5，tem perature 50℃.All of the p rotein from Sophora japonica L.sam p les contained all kinds of essential am ino acids in a balanced p roportion，which was c lose to the recommended level by WHO/FAO.The development and utilization of it should be done for its higher nutritionalvalue.

Sophora japonica L.；p rotein；aqueose two-phase system s；nutritionalevaluation

TS201.1

B

1002-0306（2014）18-0301-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.059

2013－12－06 *通讯联系人

马利华（1966-），女，硕士研究生，副教授，研究方向：食品科学与加工。