猪脱氧胆酸精制工艺的响应面分析优化

李 莉，韩 玲，余群立

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.甘肃省食品药品检验所，甘肃兰州730000）

猪脱氧胆酸精制工艺的响应面分析优化

李 莉1，2，韩 玲1，*，余群立1

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.甘肃省食品药品检验所，甘肃兰州730000）

目的：以猪脱氧胆酸粗品为原料，在单因素实验的基础上，及响应面分析法对猪脱氧胆酸精制工艺进行优化。方法：以乙酸乙酯添加量、回流时间、回流温度为响应因子，猪脱氧胆酸含量为响应值，用响应面分析法对猪脱氧胆酸粗品的提取工艺参数进行优化。结果：各因素对猪脱氧胆酸提取量的影响大小依次为乙酸乙酯添加量＞回流时间＞回流温度。猪脱氧胆酸精制的最佳工艺参数为乙酸乙酯添加量为10∶1（v∶v），回流时间为2.5h，回流温度为85℃，在此条件下，猪脱氧胆酸含量为98.78%。结论：本实验结果与预测值一致，该工艺可用于猪脱氧胆酸的精制。

猪脱氧胆酸，制备工艺，响应面分析

猪脱氧胆酸（3α，6α－二羟基胆烷酸，HDCA）是一种白色或类白色粉末的次级胆酸，具有降血脂、镇痉、祛痰等作用[1]，猪脱氧胆酸也是人工牛黄的主要原料之一，临床上用于治疗高血压，气管炎及有肝胆疾病引起的消化不良[2]，而且对急性白血病的治疗有良好作用，医用前景广阔[3]。我国猪肉资源丰富，但对猪胆汁中猪脱氧胆酸的提取利用率很低，迄今为止，对猪脱氧胆酸提取工艺研究的文献少之又少，而且国外几乎没有对这方面内容的研究，因此，进一步研究经济高效的提取方法具有很大的前景[4]。本文采用响应面分析法[5]对猪脱氧胆酸精制工艺进行优化，以提高其含量，增加其医疗价值和经济效益[6-8]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪脱氧胆酸粗品 由实验室制备所得，含量为33.67%；氢氧化钠、盐酸、乙酸乙酯、无水碳酸钠、活性炭、醋酸、糠醛、硫酸 均为分析纯。

HH-s8型电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；UV765PC型紫外分光光度计 上海光谱仪器有限公司；DZF-60A30型真空干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；85-2型恒温磁力搅拌器 常州国华电器有限公司；RE-52旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 工艺流程

1.3 操作方法

参考张文宝[9]猪脱氧胆酸的提取方法。将称重后的猪脱氧胆酸粗品[10-12]置于回流装置，加入8倍量体积的乙酸乙酯和5%的活性炭粉末进行搅拌，加热溶解后，回流1～2h。放冷后过滤，再用3～5倍的乙酸乙酯回流残渣，放冷过滤后合并滤液。在滤液中加入0.3倍量的无水碳酸钠粉末，脱水12h。将已脱水的滤液转入旋转蒸发器内，浓缩至原溶液体积的1/3～ 1/5，放冷后析出结晶[13]，滤液继续加入乙酸乙酯回流，滤物经干燥，粉碎研磨，过筛，即得猪脱氧胆酸精品[14-15]。

1.4 含量的测定

1.4.1 HDCA标准曲线的测定 参考贾霖在CACD的提取和测定时所用的方法[16]。精密称取12.5mg HDCA标准品，置于25m L容量瓶中，用体积分数为60%的醋酸溶液定容至刻度并摇匀，精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0m L，分别置于比色管中，用体积分数为60%的醋酸溶液稀释至1.0m L，加入1m L质量分数为1%的糠醛溶液，置冰浴5min，加入13m L体积分数为80%的硫酸溶液，混匀，置70℃水浴加热10m in，迅速置冰浴2m in，取出备用，同法做试剂空白实验。使用紫外分光光度计在380nm处测定其吸光度，根据测定值绘制标准曲线[17-18]，计算R2值[9]。

1.4.2 样品中HDCA的测定 精密称取12.5mg样品，加入适量体积分数为60%的醋酸液，混匀后转移至25m L容量瓶中，再用体积分数为60%的醋酸液溶解残渣，将溶解液并入容量瓶中，稀释至刻度，超声使样品完全溶解；分别在1、2两个试管中精密加入1m L上述溶液，在1管中加入1m L质量分数为1%的糠醛液，2管中加1m L水作样品空白，置冰浴中5m in，取出后加入13m L体积分数为80%的硫酸溶液，混匀，置70℃水浴中10m in，迅速置冰浴中2m in取出，同法做空白实验，使用紫外分光光度计在380nm处测定吸光度，根据吸光度计算样品中HDCA的含量[9]。

1.5 HDCA精制工艺研究

1.5.1 HDCA精制单因素实验设计 HDCA提取过程中以含量作为考察指标。以乙酸乙酯添加量、回流温度、回流时间作为影响因素。进行单因素实验，实验结果为3次实验的平均值[19]。

1.5.1.1 乙酸乙酯添加量对HDCA含量的影响 准确称取5份相同重量的HDCA粗提物，按体积比分别加入5、7、8、9、10、11倍的乙酸乙酯，处理温度为80℃，处理时间2h，每个实验做3个平行样，考察乙酸乙酯添加量对HDCA含量的影响。

1.5.1.2 回流温度对HDCA含量的影响 准确称取5份相同质量的HDCA粗提物，按其质量加入10倍体积的乙酸乙酯，处理温度分别设定为70、75、80、85、90℃，处理时间2h，每个实验做3个平行样，考察回流温度对HDCA含量的影响。

1.5.1.3 回流时间对HDCA含量的影响 准确称取5份相同质量的HDCA粗提物，按质量体积比加入10倍的乙酸乙酯，处理时间分别设定为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h，处理温度为85℃，每个实验做3个平行样，考察回流时间对HDCA含量的影响。

1.5.2 HDCA精制中心组合实验设计 为了进一步优化猪脱氧胆酸精制工艺参数，在单因素实验基础之上对乙酸乙酯的添加量、处理温度、处理时间进行三因素三水平的中心组合实验[5]。实验的因素和水平的设计见表1。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.6 数据处理

单因素实验采用Excel 2010，响应面实验采用Design-Expert 8.05b程序进行统计分析，应用Model Graph程序作响应曲面图和等高线图，并对所获得的响应面回归模型进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 HDCA精制单因素实验

2.1.1 乙酸乙酯添加量对HDCA含量的影响 由图1可以看出，HDCA含量随乙酸乙酯添加量的增大呈上升趋势，这是因为随着乙酸乙酯添加量的增大，HDCA溶解度逐渐增大，当乙酸乙酯添加量达到HDCA质量10倍体积时，HDCA的含量上升趋于平缓。根据实验结果，最佳的乙酸乙酯添加量为HDCA粗品质量的10倍体积。

图1 乙酸乙酯添加量对HDCA含量的影响Fig.1 Effectof acetic ether addition on HDCA content

图2 回流温度对HDCA含量的影响Fig.2 Effect of the reflow temperatu on HDCA content

2.1.2 回流温度对HDCA含量的影响 由图2可以看出，HDCA含量随回流温度升高而升高，这是由于随着温度的升高，HDCA不断溶解，在85℃之后含量开始缓慢下降，可能是温度过高，部分HDCA被破坏。根据实验结果，选择最佳的处理温度为85℃。

2.1.3 回流时间对HDCA含量的影响 由图3可以看出，在回流时间为1.5～2.5h范围内，HDCA含量呈上升趋势，回流时间超过2.5h后含量开始下降，这可能是由于回流时间过长HDCA不断溶解，导致含量下降，所以最佳的回流时间为2.5h。

2.2 HDCA精制中心组合实验

2.2.1 回归方程及方差分析 采用Design-Expert 8.05b对表2的数据进行多因素回归拟合。回归分析结果及各项方差分析见表3。

表2 HDCA精制工艺中心组合设计实验结果Table 2 Experimental resultof response surface design

根据回归方程各项方差分析结果表明，该模型回归显著，说明该模型与实际实验拟合较好，可以作为乙酸乙酯精制HDCA的理论值。各因素回归拟合后，得到的回归拟合方程为：

模型具有显著性（p＜0.01）。该模型与实际情况具有较好的拟合性，因此可用此模型对猪脱氧胆酸粗品中猪脱氧胆酸Y含量值进行分析和预测。

根据回归方程各个系数绝对值的大小可判断三个因素对乙酸乙酯精制HDCA影响的主次顺序为：乙酸乙酯添加量＞回流时间＞回流温度。

表3 HDCA精制工艺中心组合设计回归方程各项方差分析表Table 3 Combination design of HDCA refining technology center of the variance analysis of regression equation

2.2.2 响应面分析及最佳工艺参数的确定 根据回归方程作三因素两两交互作用的响应面图[20]。响应面坡度反映了实验各因素对响应值的影响程度。从图4～图6可以看出，回流温度和回流时间、乙酸乙酯添加量和回流时间交互作用显著，回流温度和乙酸乙酯添加量交互作用不显著。

对回归模型进行数学分析，得出乙酸乙酯精制HDCA最佳工艺参数为：乙酸乙酯添加量为10倍体积，回流温度为85℃，回流时间为2.5h，HDCA含量为97.58%。

2.3 验证实验

由图4～图6可以看出两两因子之间均有交互作用，为了验证模型的可靠性，在上述最优工艺的基础上进行反复多次的验证实验，得到HDCA含量为98.78%，与理论预测值相差较小，所以可以确定乙酸乙酯精制HDCA的最优工艺为乙酸乙酯添剂量为10倍体积，回流温度为85℃，每次回流时间为2.5h。

3 结论

通过响应面分析及验证性实验，结果表明：当乙酸乙酯添剂量为10倍体积，回流温度为85℃，回流时间为2.5h，HDCA含量为98.78%。

本实验采用乙酸乙酯纯化HDCA，通过正交实验和响应面分析得到了最佳的提取工艺参数，为利用猪胆汁进行提取纯化及加工生产HDCA添加了一条新途径；其工艺简单易行，适合工业化生产，同时也提高了猪副产物的附加值。

图4 回流时间和回流温度的交互影响响应面图Fig.4 Interactive effects of reflux time and temperature response surface graph

图5 回流温度和乙酸乙酯添加量的交互影响影响Fig.5 The reflux temperature and ethyl acetate add interactive influence the amountof influence diagram

图6 回流时间和乙酸乙酯添加量的交互影响的响应面图Fig.6 Response surface plot reflux time and ethyl acetate add interactive influence quantity ofmap

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Optim ization of the extraction technology of Hyodeoxycholic Acid by response surface methodology

LILi1，2，HAN Ling1，*，YU Qun-li1
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Gansu Province Food and Drug Institude，Lanzhou 730000，China）

Ob jective：The crude p roduc ts of Hyodeoxycholic Acid was taken as the raw material，to op tim ize the extraction technology of Hyodeoxycholic Acid by response surface methodology.Methods：The parameters of extraction technology of Hyodeoxycholic Acid were op tim ized，w ith the additive amount of ethyl acetate，the reflow time and reflow temperature as the response fac tors and yeild rate of Hyodeoxycholic Acid as response value.Results：The effects of factors in order were as follows：the add itive amount of ethyl acetate，the reflow time and reflow tem perature.The op timal extrac tion technology was as follows：the additive amount of ethyl acetate was 10∶1（v∶v），the reflow time was 2.5h，and reflow tem perature was 85℃.Under these cond itions，the maximal yield of total content reached 98.78%.Conc lusion：The results were accordantw ith model p red ictions. The technology could be used as the extraction p rocess of Hyodeoxycholic Acid.

Hyodeoxycholic Acid；p reparation p rocess；response surface methodology

TS251.1

B

1002-0306（2014）18-0260-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.049

2013－10－28 *通讯联系人

李莉（1985-），女，硕士研究生，研究方向：畜产品加工。

国家现代农业（肉牛牦牛）产业技术体系项目资助（CARS-38）；国家公益性行业（农业）科研专项经费资助（201203009）。