碱性蛋白酶提高玉米醇溶蛋白乳化性的研究

张京京，董艳娇，修 琳，刘景圣

（吉林农业大学，小麦和玉米深加工国家工程实验室，吉林长春130118）

碱性蛋白酶提高玉米醇溶蛋白乳化性的研究

张京京，董艳娇，修 琳，刘景圣*

（吉林农业大学，小麦和玉米深加工国家工程实验室，吉林长春130118）

采用Alcalase水解玉米醇溶蛋白以提高其乳化性，通过单因素实验对水解条件进行优化，研究了底物浓度、反应温度、加酶量、pH及水解时间对玉米醇溶蛋白乳化性的影响。实验得出最佳反应条件为底物浓度2%，反应温度45℃，加酶量2200U/g，pH8.0，反应时间80min。所得产物的乳化性为0.558，与未经水解的玉米醇溶蛋白乳化性相比提高了5.26倍。

玉米醇溶蛋白，Alcalase，乳化性

玉米蛋白是玉米深加工过程中主要的副产物之一，其中60%以上是醇溶蛋白[1]。玉米醇溶蛋白具有很好的成膜性、黏结性，且耐热、耐酯，被广泛应用于医疗、食品等行业[2]。吴国际等[3]研究表明，玉米醇溶蛋白在体内体外均能降解，因此在食品工业中可作为被膜剂，是一种良好的生物可降解材料。但由于玉米醇溶蛋白具有特殊的氨基酸组成，缺乏带有极性基团的氨基酸，因此水溶性、乳化性（EA）、发泡性较差，限制了人体的吸收和利用，因此需要对其进行改性以提高其应用价值。随着酶工程技术的发展，酶的限制性水解改性手段受到国内外学者的青睐[4-5]。通过酶的水解可以改变蛋白的空间结构从而改善其功能特性，同时保留了更多的营养价值。笔者通过查阅相关资料筛选了几种蛋白酶，其中A lcalase与其他的蛋白酶相比较，催化效率较高[6-7]，且在醇溶条件下仍具有较高的活性[8]。因玉米醇溶蛋白水溶性差，因此在水溶条件下限制了水解反应，水解度较低，因此本文选用A lcalase，在醇溶条件下对玉米醇溶蛋白进行水解改性。旨在提高玉米醇溶蛋白的乳化性，为玉米醇溶蛋白的进一步开发和利用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米醇溶蛋白 上海金穗生物科技有限公司；诺维信A lcalase 北京高瑞森科技有限公司代理销售；无水乙醇、十二烷基硫酸钠（SDS） 北京鼎国昌盛技术有限公司；大豆油 市售。

723-PC可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司；恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂；LD5-2B低速离心机 北京雷勃尔离心机有限公司；FA25上海弗鲁克乳化机 上海弗鲁克流体机械制造有限公司；RE-52A旋转蒸发仪、SHZ-III循环真空泵 上海亚荣生化仪器场；LGJ-12冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水解玉米醇溶蛋白 取一定量的玉米醇溶蛋白，用70%的乙醇配制50m L一定质量浓度的蛋白溶液，用0.2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH，加入Alcalase预处理20m in，迅速将反应液与50℃下进行真空浓缩出去1/2的乙醇，用去离子水补充至原体积，用0.2mol/L的氢氧化钠溶液调节至原pH，继续水解，85℃水浴灭酶终止反应，产物过滤，冻干待用[9]。

1.2.2 蛋白质乳化性的测定 配制蛋白含量为1%的溶液50m L。加入15m L大豆油，在10000r/m in，25℃下搅拌1m in，从搅拌后的溶液底部吸取50μL乳浊液，加入到5m L 0.1%SDS溶液中，测定其在500nm处的吸光值，以SDS溶液为空白，0m in时测得的吸光值A0即乳化性EA[10-11]。

1.3 Alcalase水解玉米醇溶蛋白单因素实验

1.3.1 底物浓度对水解产物乳化性的影响 用70%的乙醇溶液分别配制浓度为1%、2%、3%、4%、5%的玉米醇溶蛋白溶液，调节pH至8.0，按照1.2.1水解过程于40℃条件下水解60m in，加酶量为1760U/g。将产物冻干，分别测定其乳化性。

1.3.2 温度对水解产物乳化性的影响 用70%的乙醇配制成2%的蛋白溶液，调节pH至8.0，按照1.2.1水解过程，分别于40、45、50、55、60℃的条件下水解水解60min，加酶量为1760U/g。将水解产物冻干，测定其乳化性。

1.3.3 加酶量对水解产物乳化性的影响 用70%的乙醇配制2%的蛋白溶液，分别按照加酶量1320、1760、2200、2640、3080U/g分别加入A lcalase水解蛋白酶，调节pH至8.0。按照1.2.1水解过程于45℃条件下水解60min。将水解产物冻干，测定其乳化性。

1.3.4 pH对水解产物乳化性的影响 用70%的乙醇配制2%的蛋白溶液，分别调至pH 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，按照1.2.1水解过程于45℃条件下水解60m in，加酶量为2200U/g。将水解产物冻干，测定其乳化性。

1.3.5 水解时间对产物乳化性的影响 用70%的乙醇配制2%的蛋白溶液，调pH至8.0，加酶量为2200U/g，于45℃条件下经20m in初步水解后，分别于40、60、80、100、120min时取样，将水解产物冻干，测定其乳化性。

2 结果与分析

2.1 底物浓度对水解产物乳化性的影响

图1 底物浓度对蛋白乳化性的影响Fig.1 Theeffectofconcentrateofsubstrateon emulsibilityofZein

由图1可知，随着底物浓度的增加，玉米醇溶蛋白的乳化性有所增加，而后又降低，随后又有所增加，在底物浓度为2%时蛋白水解物获得最大的乳化性0.498。其原因分析为，随着底物浓度的增加水解度也有所提高，同时多肽数量增加，蛋白质分子中静电荷数量增加，因此蛋白的乳化性有所提高。但随着底物浓度的增加，水解度的进一步增加，亲水性也随之增加，吸附油滴的能力有所下降，反而又降低了乳化性[12]，因此在底物浓度为3%时乳化性降低，随后在底物浓度为4%时又有所升高，分析原因可能为，底物浓度与酶解反应速度直接相关，当底物浓度过高时水解度是有所下降的[13]，因此乳化性有略微升高。

2.2 温度对水解产物乳化性的影响

图2 水解温度对蛋白乳化性的影响Fig.2 The effectof temperature on emulsibility of Zein

图2可知，随着温度的升高，玉米醇溶蛋白的乳化性呈先升高后降低的趋势，在水解温度为45℃时获得最大的乳化性0.516。沈宁和杨光[13]在研究中发现花生蛋白使用枯草杆菌蛋白酶水解后也出现了类似的结果。原因分析可能为：温度对酶的活性有着直接的影响，随着温度的升高酶促反应速率增加，蛋白水解度升高，肽链数量增加，减小了油-水界面张力，从而提高了乳化性，但温度高于45℃以后酶逐渐失活，反应速率大幅下降，乳化性也随之下降[14]。

2.3 加酶量对水解产物乳化性的影响

图3 加酶量对水解产物乳化性的影响Fig.3 The effectof concentrate ofenzyme on emulsibilityof Zein

由图3可知，随着加酶量的增加，玉米醇溶蛋白的乳化性呈先升高后降低的趋势。在加酶量为2200U/g时获得最大乳化性0.542。当加酶量较小时酶分子与底物充分接触，蛋白水解度随着加酶量的增加而增大[15]，肽链数量增加，肽链水解程度增大提高了蛋白分子的柔韧性，减小了油-水界面张力[16]，从而使蛋白的乳化性升高。当水解度过高时，蛋白的分子量过低，吸附油滴性能力下降，因此乳化性下降。

2.4 pH对蛋白乳化性的影响

图4 pH对蛋白乳化性的影响Fig.4 The effectof pH on emulsibility of Zein

由图4可知，随着pH的升高，玉米醇溶蛋白的乳化性呈先增高后降低的趋势，在pH（8.0）时乳化性最高，为0.542。由图4可见，在pH 7.0～8.0区间乳化性上升趋势较为明显，pH低于7.0时乳化性较低，原因可能为：反应体系的pH直接影响酶的活性及蛋白质分子的解离状态，A lcalase在酸性条件下活性较差，所以pH低于7.0时蛋白的水解度较低，肽链的水解程度较低，因此乳化性较差；当蛋白溶液pH高于8.0时，蛋白的解离度增加，所带静电荷数增加，但由于A lcalase在该条件下的活性较高，肽链水解程度过高，分子量过低，吸附油滴的能力下降，因而乳化性总体呈下降趋势。

2.5 水解时间对蛋白乳化性的影响

图5 水解时间对蛋白乳化性的影响Fig.5 The effectof reaction time on emulsibility of Zein

由图5可知，随着时间的延长，由于酶促反应不断进行，蛋白的水解度逐渐升高。蛋白的乳化性在前80m in不断升高，80m in以后乳化性逐渐下降。分析原因可能为，在前80min里，随着蛋白水解度的增加，肽链数量增加，蛋白分子的柔韧性增加，减小了油-水界面的张力，因此乳化性有所提高。但是80m in以后，由于蛋白水解度过大，蛋白的亲水能力增加，吸附油滴的能力降低，乳化性也随之降低。因此最适反应时间为80m in，此时乳化性为0.558。

2.6 未经水解的蛋白乳化性与水解后蛋白乳化性的比较

按照单因素实验优化的最佳水解条件将玉米醇溶蛋白进行水解，水解后玉米醇溶蛋白蛋白乳化性为0.558，而未经水解的蛋白乳化性仅为0.106。

3 结论

根据本研究的单因素实验可知，A lcalase提高玉米醇溶蛋白乳化性的最佳酶解条件为底物浓度2%、反应温度45℃、加酶量2200U/g、pH 8.0、水解时间为80min。该条件下玉米醇溶蛋白的乳化性为0.558，与未经水解处理的玉米醇溶蛋白乳化性相比提高了5.26倍。

[1]谦伟，郭兴风，熊拯.玉米的综合开发-醇溶蛋白的提取[J].粮食科技与经济，2006（6）：43-46.

[2]Y Wang，GW Padua.Water sorption properties of extrusion blown zein films[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（10）：3100-3105.

[3]吴国际，吕长波，鲁传华，等.玉米醇溶蛋白的物理化学改性[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（25）：4665-4668.

[4]M Darewicz，J Dziuba，P Caessens.Effect of enzymatic hydrolysison emulsifying and foaming propertiesofmilk proteinsa review[J].Pol JFood Nutr Scj，2000，9（1）：3-8.

[5]张锐昌，徐志宏，刘邻渭.小麦蛋白改性技术的研究进展[J].粮食与饲料工业，2006（2）：25-28.

[6]董颖超.蛋白酶对大豆蛋白的水解特性及动力学性质的研究[D].北京：中国农业大学，2001.

[7]宋占兰.玉米蛋白的生物法水解及产物的性质研究[D].齐齐哈尔：齐齐哈尔大学，2012.

[8]ST Chen，SY Chen，KTWang.Kinetically controlled peptide bond formation in anhydrous alcohol catalyzed by the industrial protease alcalase[J].The Journal of Organic Chemistry，1992，57：6960-6965.

[9]杨晓泉.二步法酶水解玉米醇溶蛋白的方法[P].中国专利，200410077518.1.2005-08-31.

[10]KM Pearce，JE Kinsella.Emulsifying properties of proteins：Evaluation of a turbidimetric technique[J].Agric Food Chemistry，1978，26（3）：716-723.

[11]S Tang，NS Hrttiarachchy，R Horax，et al.Physicochemical properties and functionality of rice bran protein hydrolyzate prepared from heat-stabilized defatted rice bran with the aid of enzymes[J].Journal of Food Science，2003，68（1）：152-157.

[12]管军军，裘爱泳，周瑞宝.提高大豆分离蛋白乳化性及乳化稳定性的研究[J].中国油脂，2003（28）：38-42.

[13]宋占兰，郑喜群，刘晓.Alcalase酶解高底物浓度玉米蛋白工艺优化[J].食品与机械，2011，27（6）：226-231.

[14]沈宁，杨光.酶改性提高花生蛋白乳化性的研究[J].食品工业，2008（2）：28-31.

[15]李磊，迟玉杰，王喜波.琥珀酰化提高大豆分离蛋白乳化性的研究[J].中国粮油学报，2010，25（9）：17-22.

[16]何莉萍，刘良忠.中性蛋白酶和碱性蛋白酶对玉米蛋白水解作用的研究[J].食品科学，2008，29（3）：152-157.

[17]张平安，赵秋艳，李宁，等.响应曲面优化木瓜蛋白酶提高大豆分离蛋白乳化性的研究[J].河南农业大学学报，2011，45（5）：585-589.

Study on zein modified by alcalase to im prove the emulsifying ability

ZHANG Jing-jing，DONG Yan-jiao，XIU Lin，LIU Jing-sheng*
（Jilin Agricultural University，National Engineering Laboratory of theWheat and Corn Deep Processing，Changchun 130118，China）

To imp rove the emulsification of zein，this research app lied the method of Alcalase hyd rolyzation.The hyd rolysis cond ition was op tim ized on the basis of substrate concentration，reaction tem perature，alcalase concentration，pH，reaction time experiments.After the op timal reaction cond itions of im p roving the emulsification of zein were conc luded as follows：substrate concentration 2%，reac tion tem perature 45℃，enzyme amount 2200U/g，pH8，reac tion time 80m in.Under the op timal cond ition，the EA of zein was 0.558.The emulsification imp roved 5.26 times compared w ith non-hyd rolyzed zein.

zein；Alcalase；emulsification

TS201.1

B

1002-0306（2014）18-0253-03

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.047

2013－10－10 *通讯联系人

张京京（1988-），女，硕士研究生，研究方向：食品微生物学与生物技术。

“十二五”支撑计划（2012BAD37B05）。