不同萃取方法对山楂汁香气成分测定的影响

田甜甜，王积武，吴志莲，王洋洋，牛 浩，赵玉平，*

（1.烟台大学生命科学学院，山东烟台264005；2.绿杰股份有限公司，山东龙口265718）

不同萃取方法对山楂汁香气成分测定的影响

田甜甜1，王积武2，吴志莲2，王洋洋1，牛 浩1，赵玉平1，*

（1.烟台大学生命科学学院，山东烟台264005；2.绿杰股份有限公司，山东龙口265718）

为研究不同的萃取方法对山楂汁香气成分测定的影响，采用顶空固相微萃取（HS-SPME）和液液萃取（LLX）对山楂汁中的香气成分进行富集，并结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）对其进行定性和半定量分析。结果表明，HSSPME共检测出21种香气成分，主要是顺-3-己烯醇、α-萜品醇、顺-乙酸-3-己烯酯、顺-丁酸-3-己烯酯、苯甲醇和甲酸己酯等，其含量分别为79.4、68.1、60.4、60.1、49.9、33.2μg/L；LLX共检测出20种香气成分，主要是顺-3-己烯醇、顺-乙酸-3-己烯酯、顺-丁酸-3-己烯酯、丁子香酚、丙酮酸乙酯和柠檬酸，其含量分别67.9、63.4、57.4、51.4、34.5、30.3μg/L。通过比较分析可知，不同的方法因工作原理不同，得到的香气成分不同且含量差异较大。

山楂汁，香气成分，顶空固相微萃取（HS-SPME），液液萃取（LLX），气相色谱-质谱联用（GC-MS）

山楂作为传统的药食两用植物，其营养成分极其丰富，且含有黄酮类、酚酸类、有机酸和萜类等物质[1]，具有降血脂、抗癌、抗衰老等功能[2-3]。香气成分是构成和影响果实及果汁质量与典型性的主要因素[4]。虽然食品中香气成分的含量非常低，但是这些物质直接影响着人们的食欲，同时在饮料的生产调配过程中也有着重要影响。

国内外有关山楂香气成分的研究文献报道较少[5]。近年来，朱晓兰等[6]采用连续液液萃取技术并结合GC-MS收集山楂中的挥发性物质，认为顺-3-己烯醇和丁子香酚等是山楂香气的代表性化合物；谢笔钧等[7]采用蒸馏-萃取法收集山楂中的挥发性物质，认为顺-3-己烯醇、顺-3-乙酸己烯酯和α-萜品醇等是山楂汁香气成分的代表。HS-SPME技术操作简便、耗费低、易于实现自动化，而LLX可以充分将样品中的痕量物质萃取出来。由于山楂汁中的香气成分较为复杂，各种提取方法的原理不同，所得到的香气物质是否一致，差异是否显著，目前尚无相关的报道。本实验采用HS-SPME和LLX两种萃取方法并结合GC-MS对山楂汁中香气成分进行定性和内标法定量分析，并对两种不同的提取方法进行对比研究，为进一步完善山楂的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

新鲜山楂果 山东烟台，市售，无腐烂，无病虫害；果胶酶（10U/m L） RAPIDASE公司；NaCl上海国药集团，分析纯；3-辛醇（内标） Sigma公司，色谱纯；正十七烷（内标） 天津市彪仕奇科技发展有限公司，色谱纯；C10～C25直链烷烃标准品 Sigma公司，色谱纯；二氯甲烷 天津化学试剂厂，分析纯；无水硫酸钠 青岛市盛美化工有限公司，分析纯。

GC-MS-2010 日本津岛公司；DB-Wax型色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm） 美国Agilent公司；SPME萃取头（50μm/30μm CAR/DVB/PDMS） 美国Supelco公司；微量进样器 上海安亭微量进样器厂；低速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；磁力搅拌器 龙口先科仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 选取1kg无腐烂的山楂，去梗后称重并清洗干净，按山楂和水质量1∶1，煮至山楂开裂，停止加热，制成果酱，冷却至50℃时加入1m L果胶酶，混匀，酶解6h，然后以转速4000r/m in离心20m in，取上清液，即为山楂汁[8]。

1.2.2 样品预处理

1.2.2.1 顶空固相微萃取 取5.00m L山楂汁加入20m L的萃取瓶中，加入2.0g NaCl、1μL的内标3-辛醇和转子，加盖封口；置于50℃恒温水浴中预平衡10min，将萃取头插入样品瓶中的顶空部分，吸附5m in后进行GC-MS分析。样品重复6次。

1.2.2.2 液液萃取 取5.00m L山楂汁加入100m L 100g/L食盐水、100μL的内标正十七烷，充分搅匀后转移至预先在底部加入10m L二氯甲烷的萃取器后，再向烧瓶中加入40m L二氯甲烷，置于65℃恒温水浴进行加热，连续萃取5h。取下装置后，向二氯甲烷溶液中加入无水硫酸钠固体，干燥后，浓缩至1m L，取1μL进行GC-MS分析[6]。样品重复6次。

1.2.3 GC-MS条件

1.2.3.1 GC条件 色谱柱：DB-Wax柱（30m×0.25mm× 0.25μm）；升温程序：初始温度40℃，保持2m in，然后以6℃/m in升温至100℃，再以5℃/m in升温至150℃，最后以10℃/min升温至230℃，保持4min；溶剂延迟1m in；进样口温度和检测器温度230℃；载气（He）流速2m L/m in，压力61.8kPa；采用不分流进样模式。

1.2.3.2 MS条件 电子轰击（EI）离子源；电子能量70eV；离子源温度200℃；接口温度230℃；扫描范围：m/z 30～500。

1.3 香气成分的鉴定

1.3.1 香气成分的定性 将C10～C25的直链烷烃标准品单独进样，进行GC-MS分析，得到每一种烷烃的保留时间；根据参考文献[9]保留指数的计算公式，计算每一种组分的保留指数；与NIST Library工作站标准谱库自动检索各组分质谱数据、参照试剂公司提供的标准谱图对机检结果进行核对确认以及相关的文献资料[11，15，18，20]进行比较，进一步确定香气成分。

1.3.2 香气成分的定量 根据以下方法计算各组分含量[10-11]：

2 结果与讨论

图1为山楂汁经过不同方法萃取后，在DB-Wax柱上通过GC-MS分析得到的总离子流图。各组分质谱经NIST Library检索并根据C10～C25直链烷烃标准品和资料分析共检测出27种香气成分及含量如表1所示。

所检测的27种香气成分中，酯类、萜烯类、芳香类、醇类、酸类、呋喃类和醛类构成了山楂汁的主要的香气成分。HS-SPME和LLX得到的组分几乎相同，各有21和20种。每种方法所检测到的香气成分相似但又有所差别。就HS-SPME而言，顺-3-己烯醇的含量最高，依次是α-萜品醇、顺-乙酸-3-己烯酯、顺-丁酸-3-己烯酯和苯甲醇等。这些组分的大量存在与文献中的结果是相一致[7]；而LLX萃取到的组分中，顺-3-己烯醇的含量最高，依次是顺-乙酸-3-己烯酯、顺-丁酸-3-己烯酯、丁子香酚、丙酮酸乙酯和柠檬酸等。

图1 不同方法萃取山楂汁香气成分的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of differentextractionmethod on aroma components of hawthorn juice

2.1 酯类组分分析

由表1可以看出，使用HS-SPME共检测出8种酯类物质，主要包括顺-乙酸-3-己烯酯、顺-丁酸-3-己烯酯、甲酸己酯、乙酸乙酯和己酸乙酯等；而使用LLX检测出11种酯类物质，顺-乙酸-3-己烯酯、顺-丁酸-3-己烯酯、丙酮酸乙酯、己酸乙酯和柠檬酸三乙酯等，其中7种物质是两种方法都检测到的且各物质之间的含量差异较小。丙酮酸乙酯、肉桂酸乙酯、柠檬酸三乙酯和硬脂酸乙酯这4种物质是LLX检测到而HS-SPME没有检测到的。另外，HS-SPME检测出乙酸乙酯，而LLX没检测出，这是因为LLX容易受到溶剂的干扰，低沸点的物质如乙酸乙酯检测不出[12]。

表1 山楂汁中各香气成分及含量Table 1 Aroma components and its contents of hawthorn juice

乙酯类组分的合成由醇类和乙酰-CoA在醇酰基转移酶的作用下缩合而成的[13]。有研究发现顺-乙酸-3-己烯酯的含量可以作为山楂成熟的标志[7]，是主要的香气成分之一。顺-乙酸-3-己烯酯具有山楂汁特有的清香味，甲酸己酯具有苹果或未成熟梅子香气，己酸乙酯具有水果味和甜味，而顺-丁酸-3-己烯酯具有清香或花香型香气[11]。

2.2 萜烯类组分分析

本实验中使用HS-SPME共检测出5种萜烯类物质，包括α-萜品醇、4-松油醇、里那醇、香叶酮和紫罗兰酮，其中α-萜品醇、4-松油醇和里那醇的含量非常高；而LLX只检测到少量的紫罗兰酮。

挥发性萜类物质如α-萜品醇、4-松油醇和里那醇等物质是由各种化学反应和酶转移反应形成的[14]。α-萜品醇是酸解后产生的，有凤梨香气，4-松油醇具有泥土香气和香辛料香气，而里那醇赋予山楂汁强烈的花香并具有柑橘香气[11，15]。紫罗兰酮具有紫罗兰的香气，它是由柠檬醛与丙酮经缩合、环化直接合成得到的[16]。

2.3 醇类组分分析

从表1中可以看出，使用HS-SPME和LLX都检测出2种醇类物质，包括顺-3-己烯醇和反-3-己烯醇，且这两种物质的含量差异较大，顺-3-己烯醇是含量最高的香气成分，而反-3-己烯醇含量较少。

山楂中亚油酸和亚麻酸的含量较高，通过脂肪氧化酶的降解途径，亚麻酸最终转化为顺-3-己烯醇，而顺-3-己烯醇具有强烈的新鲜青草香味，而且扩散力强，用于香精中，能产生满意的新鲜香气和自然感，并能掩盖其他不良气味[6]。

2.4 芳香类组分分析

根据表1所示，在山楂汁中共检测到5种芳香类物质，其中2种物质是这两种方法都检测出的，分别为间二甲苯和邻二甲苯，两种物质含量差异较小。苯甲醇和2，4-二叔丁基苯酚是HS-SPME检测出的，2，4-二叔丁基苯酚有香草味，而含量较大的苯甲醇具有花香味。LLX检测出具有强烈的丁香气味的丁子香酚[17]，其含量非常高，HS-SPME没有检测出这一物质。虽然有些物质含量很低，但是各香气成分间的相互作用对山楂汁香气形成有重要作用，即可构成该果汁的特征香气成分，赋予山楂汁独特的香气风味。

2.5 其他组分分析

根据表1可以看出，HS-SPME和LLX同时都检测出1种醛和1种呋喃类物质，分别为具有水果味的壬醛和烧烤味的糠醛[18]，且不同方法检测出的各物质的含量差异不是很明显。糠醛是由戊聚糖在酸的作用下水解生成戊糖，再由戊糖脱水环化而成。LLX中还检测到柠檬酸，柠檬酸是山楂汁中重要的物质[19]，酸类化合物的产生源于脂肪酸合成酶的合成以及脂质β-氧化的降解。

3 结论

HS-SPME利用萃取头直接顶空吸附样品，吸附的物质主要是低沸点的酯类、醇类、萜烯类和芳香类等，LLX萃取的物质除了低沸点的酯类、醇类、芳香类外，还有高沸点的酸类和酯类等。HS-SPME和LLX分别检测出21和20种香气成分，其中酯类、醇类、芳香类和萜烯类是对香气贡献最大的四类组分。对于HS-SPME来说，顺-3-己烯醇、α-萜品醇、顺-乙酸-3-己烯酯、顺-丁酸-3-己烯酯、苯甲醇和甲酸己酯是主要香气成分，其含量分别79.4、68.1、60.4、60.1、49.9、33.2μg/L；对于LLX，顺-3-己烯醇、顺-乙酸-3-己烯酯、顺-丁酸-3-己烯酯、丁子香酚、丙酮酸乙酯和柠檬酸是主要香气成分，其含量分别67.9、63.4、57.4、51.4、34.5、30.3μg/L。各香气成分含量之间存在较大差异，但是各香气成分间相互作用，共同赋予山楂汁独特的香气风味。

[1]Wang H，Zhang Z S，Guo Y，et al.Hawthorn fruit increases the antioxidant capacity and reduces lipid peroxidation in senescence-accelerated mice[J].European Food Research and Technology，2011，232（5）：742-751.

[2]赵玉平.山楂综合利用和研究开发[D].天津：天津科技大学，2004.

[3]杨志娟.山楂苹果复合饮料研制[J].食品研究与开发，2002，23（6）：64-65.

[4]李华.葡萄与葡萄酒研究进展[M].西安：陕西人民出版社，2001.

[5]Qi C，Min Z，Zhong Z，et al.High-performance liquid chromatographic method for simuhaneous determination of hawthorn active components in rat plasma[J].Journal of Chromatography B，2001，760（2）：227-235.

[6]朱晓兰，吕春伟，高芸.山楂酊挥发性化合物的气相色谱-质谱分析[J].卫生研究，2004，33（1）：108-110.

[7]谢笔钧，陈凌云，胡慰望.山楂挥发性化合物的研究[J].食品与发酵工业，1997，23（2）：42-46.

[8]渠飞翔，张海娣，李光珍，等.山楂汁中有机酸和总黄酮吸附动力学研究[J].食品工业科技，2012，33（22）：109-112.

[9]Fan W L，Qian M C.Characterzation of aroma compounds of Chinese“Wuliangye”ang“Jiannanchun”liquor by aroma extract dilution analysis[J].Journal of Agriculture and Food Chemist，2006，54（2）：2695-2704.

[10]Caven-Quantrill D J，Buglass A J.Comparison of microscale simultaneous distillation-extraction and stir bar sorptive extraction for the determination of volatile organic constituents of grape juice[J].Journal of Chromatogr A，2006，1117（2）：121-131.

[11]Zhao Y P，Xu Y，Li JM，et al.Profile of volatile compounds in brandies by Headspace Solid-Phase Microextraction followed by Gas Chromatography-Mass Spectrometry[J].Food Science，2009，74（2）：90-99.

[12]Kolahgar B，Hoffmann A，Heiden A C.Application of stir bar sorptive extraction to the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in aqueous samples[J].Journal of Chromatography A，2002，963（1）：225-230.

[13]Mason A B，Dufour JP.Alcohol acetyltransferases and the significance of ester synthesis in yeast[J].Yeast，2000，16（14）：1287-1298.

[14]Laura P，Cecilia N，Francesca D A，et al.Composition of volatile in micropropagated and field grown aromatic plants from Tuscany Islands[J].Acta biochimica Polonica，2013，60（1）：43-50.

[15]Zhao Y P，Li JM，Xu Y，et al.Characterization of aroma compounds of four brandies by aroma extract dilution analysis[J]. American Journal of Enology and Viticulture，2009，60（3）：269-276.

[16]唐健.紫罗兰酮的合成及应用[J].化学推进剂与高分子材料，2007，5（1）：43-45.

[17]Vicente F，Ricardo L，Juan FC.Quantitative determination of the odorants of young red wines from different grape varieties [J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2000，80（11）：1659-1667.

[18]Zhao Y P，Zheng X P，Song P，et al.Characterization of volatiles in the sixmostwell-known distilled spirits[J].American Society of Brewing Chemists，2013，71（3）：161-169.

[19]Patricia G S，David A R，Antonio SC，et al.Influence of technological processes on phenolic compounds，organic acids，furanic derivatives，and antioxidant activity of whole-lemon powder[J].Food Chemistry，2013，141（2）：869-878.

[20]Ledauphin J，Milbeau C L，Barillier D，et al.Differences in the volatile compositions of French Labeled Brandies（Armagnac，Calvados，Cognac，and Mirabelle）using GC-MSand PLS-DA[J]. Journal of Agriculture and Food Chemist，2010，58（13）：7782-7793.

Effect of different extraction method on the identification of aromatic com ponents of haw thorn juice

TIAN Tian-tian1，WANG Ji-wu2，WU Zhi-lian2，WANG Yang-yang1，NIU Hao1，ZHAO Yu-ping1，*
（1.College of Life Science，YantaiUniversity，Yantai264005，China；2.LvJie Co.，Ltd.，Longkou 265718，China）

To study the effect of different extrac tion methods on the aromatic com ponents of haw thorn juice，headspace solid phase m icro-extraction（HS-SPME）and liquid-liquid extraction（LLX）coup led w ith gas chromatog raphy mass spectrometry（GC-MS）were developed and app lied for the qualitative and sem iquantitative characterization of aroma com ponents of haw thorn juice.The results showed that a total of 21 com pounds were identified by HS-SPME.（Z）-3-hexen-1-ol，α-terp ineol，（Z）-3-hexenyl acetate，（Z）-3-hexenyl butyrate，benzyl alcohol and hexyl formate were the main com ponents，and its contents were 79.4，68.1，60.4，60.1，49.9，33.2μg/L，respec tively.Compared w ith HS-SPME，6 main aroma components were found by LLX，such as（Z）-3-hexen-1-ol，（Z）-3-hexenyl acetate，（Z）-3-hexenyl butyrate，eugenol，ethyl pyruvate and citric acid，and its contents were 67.9，63.4，57.4，51.4，34.5，30.3μg/L，respectively.Nevertheless，based on different p rincip les，the contents of aroma components were obvious d ifferences in contents w ith differentmethods.

haw thorn juice；aroma com ponents；HS-SPME；LLX；GC-MS

TS201.1

A

1002-0306（2014）18-0153-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.024

2013－12－09 *通讯联系人

田甜甜（1987-），女，硕士研究生，研究方向：蒸馏酒风味分析。

山东省自然科学基金（ZR2011CM206）。