基于Hemin/多壁碳纳米管纳米复合物构建的过氧化氢生物传感器的研究

夏 志 张 宇 李黔柱 刘 红

(毕节学院 化学工程学院，贵州 毕节 551700)

0 前言

过氧化氢(H2O2)是生物体内许多氧化酶如葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶和乙醇氧化酶等反应的副产物，也是许多工业生产过程的原料或中间产物，因此通过H2O2的测定可以间接地测定其它目标物的浓度，对其含量的测定在生物、环境、临床、工业和食品分析中具有重要意义[1-2]。目前，测定H2O2的方法有电化学法[3-5]、分光光度法[6]、化学发光法[7-8]和滴定法[9]等，其中电化学方法因其方法简单、灵敏度高、选择性好、能在线监测等特点被广泛关注，尤其是利用辣根过氧化物酶(HRP)构建的H2O2传感器的报道尤其多，因为酶传感器具有专一性高、反应速度快等优点。然而，酶传感器无论怎样改进都要依赖于酶的催化，而酶又有其自身的缺陷，比如，酶的活性会随放置的时间而降低、对pH值及温度比较敏感、价格昂贵、在催化氧化过程中容易受水中溶解氧的干扰等。在将酶固定到电极上时也会产生一些问题，如将酶固定到电极上的材料生物相容性不好，致使酶变性；固定到电极表面的酶数量有限等。因此，构建无酶型的传感器对进一步提高生物传感器的性能将起到积极的影响。

Hemin是一类重要的有机共轭分子，可以模拟许多酶的活性中心[10-12]。在生物体内，许多金属蛋白酶经常自组装成纳米尺度的超分子结构来实现其基本的生物催化作用。Hemin可以通过共价或者非共价作用有序组装在纳米材料上，实现其模拟金属蛋白酶的功能。而且Hemin是良好的电子媒介体，对生命过程相关小分子的氧化还原具有较好的电催化活性[13-14]。因此，Hemin纳米组装形成的纳米材料复合物可用于新型电化学生物传感器的构建。

本研究利用Hemin具有模拟酶的这种性质，与多壁碳纳米管(MWCNTs)通过π-π键作用制成Hemin/MWCNTs的纳米复合物，采用滴涂技术并在nafion的作用下将其固载在电极表面，构建nafion/Hemin/MWCNTs修饰的玻碳电极(nafion/Hemin/MWCNTs/GCE)。该修饰电极具有催化作用强、制备简单、灵敏度高、稳定性及重复性好等特点。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

CHI660D电化学工作站(上海辰华)，KS-250科生牌超声清洗仪(宁波海曙科生超声有限公司)，微量进样器(10 mL，上海)，pH计(上海精科)，X85-2恒温磁力搅拌器(上海梅颖清)，紫外光谱仪(cary50型)，实验采用三电极体系(经修饰的玻碳电极为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂丝电极为对电极)。

Hemin(C34H33FeN4O5)来自天津市光复精细化工厂、MWCNTs、氯化钾、磷酸和氢氧化钠均购自国药集团化学试剂有限公司，H2O2(浓度30%，分析纯)购自重庆化学试剂厂，其余试剂均为分析纯。由Na2HPO4-NaH2PO4配制pH值为3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.0，8.5，9.0的PBS缓冲溶液，实验用水均为二次蒸馏水。

1.2 Hemin/MWCNTs复合物生物传感器的制备

将0.05 g的Hemin溶于10 mL氢氧化钠(2 mol/L)溶液中，再称取0.05 g的MWCNTs溶于二次蒸馏水中，进行超声后，各取5 mL溶液充分混合。如图1所示，将5 μL Hemin/MWCNTs的复合物滴加于玻碳电极的表面，室温下晾干，最后将2 mL nafion(5%，V/V)滴于电极表面即制得nafion/Hemin/MWCNTs修饰的H2O2生物传感器。

图1 修饰电极的制备过程图Figure 1 Schematic diagram for preparation process of the modified electrode.

2 结果与讨论

2.1 Hemin/MWCNTs纳米复合物的SEM及TEM表征

图2A为Hemin/MWCNTs复合物的透射电镜(TEM)图。可以看到，Hemin/MWCNTs复合物呈管状且分散均匀；图2B为Hemin/MWCNTs复合物的扫描电镜(SEM)图，其在电极表面形成了一种疏松多孔的三维杂化结构，这种结构有利于保留MWCNTs的优良性质，促进电子的传输，并增加电极的有效比表面积。

2.2 UV-Vis光谱表征

采用UV-Vis光谱技术对制得的纳米复合物进行了表征，结果如图3所示，从图中可以看出，Hemin溶液(b)在390 nm处出现了明显的吸收峰，MWCNTs(c)溶液在248 nm处有明显的吸收峰，而Hemin/MWCNTs溶液在388 nm及251 nm处均出现了明显的吸收带，这表明Hemin/MWCNTs纳米复合物成功地合成了，且各自保持了其良好的性质。

图2 Hemin/MWCNTs纳米复合物的透射电镜(A)和扫描电镜图(B)Figure 2 TEM (A) and SEM (B) images of Hemin/MWCNTs composite.

图3 Hemin/MWCNTs溶液的UV-Vis光谱表征图Figure 3 The UV-Vis spectroscopy of Hemin/MWCNTs solution.

2.3 修饰电极的循环伏安电化学表征

图4是不同的修饰电极在pH值为6.0的PBS(0.1 mol/L)中的循环伏安图。图4中a为裸的玻碳电极，没有明显的氧化还原峰；当修饰有MWCNTs时(图4中b)，在0 V左右可以观察到一对氧化还原峰，这是MWCNTs的特征峰，说明MWCNTs成功修饰到了电极表面；当电极修饰有Hemin/MWCNTs复合物时(图4中c)，在-0.4 V及0 V左右分别有一对明显的氧化还原峰，且氧化还原峰的峰电流均有所增大，说明Hemin具有良好的导电性。-0.4 V左右的氧化还原峰为Hemin中Fe3+的氧化还原峰[15]，0 V左右的为MWCNTs的特征峰，说明Hemin/MWCNTs成功修饰到了电极表面。

图4 不同修饰电极的循环伏安表征图Figure 4 Cyclic voltammogram curves of the different modified electrodes.

2.4 实验条件的优化

(1)pH值的优化

测试底液的pH值对生物分子的催化反应及其活性有重要影响。图5考察了修饰电极在pH=3.5～9.0的PBS(0.1 mol/L)缓冲溶液中对H2O2的响应。改变pH值，采用计时电流法记录其电流响应。结果表明，当pH值由3.5升至6.0时，电极电流响应逐渐增加；当pH>6.0后，电流响应开始下降，且电极变得不稳定，故本实验选用的pH=6.0的PBS为测试底液。

(2)扫描速率的选择

图6是Hemin/MWCNTs复合物修饰玻碳电极在含有H2O2(3.5×10-1mol/L)的PBS(pH=6.0)中，在-0.6～0.0 V电位范围内，以不同扫描速度进行扫描的循环伏安图。从图6中可以看出，随着扫描速度的不断增加，氧化还原峰电流均明显增大，在10～100 mV/s范围内氧化还原峰电流值与扫描速率呈良好的线性关系(见插图6B)，氧化峰 和还原峰的关系式分别为 ：ipa=1 463.2v+2.1796，相关系数R=0.999；ipc=-1 506v-6.990 1，其相关系数R=0.999，其中：ipa和ipc为峰电流，单位为mA；v为电压扫描速率，单位为V/s。说明此修饰电极在电化学过程是受扩散控制的。

图5 pH值对修饰电极响应电流的影响Figure 5 Influence of pH on current response of a modified electrode.

(3)传感器响应性能的研究

如图7所示，当溶液中分别加入10 μL过氧化氢(3.5×10-1mol/L)时，Hemin/MWCNTs修饰电极在-0.2 V下电流有明显的增加，说明在该电位下修饰电极对H2O2有较高的灵敏度。相关的实验原理如下[16-17]：

Hemin(Fe3+)+H2O2→Compound I (Fe4+=O)+H2O

Compound I(Fe4+=O)+H++e-→Compound II

Compound II+H++e-→Hemin(Fe3+)+H2O

图6 (A)Hemin/MWCNTs修饰玻碳电极在不同扫描速率下的循环伏安图 (B)为扫描速率与峰电流的线性关系图Figure 6 (A)Cyclic voltammongram curves of MWCNTs/Hemin/GCE at different scanning rates (pH=6.0). (B) The peak current vs scan rate.

图7 修饰电极对H2O2的循环伏安响应图Figure 7 CV responses of the modified electrode to H2O2.

图8是在优化的实验条件下，修饰电极对在PBS中分别加入不同浓度的H2O2时的计时电流响应图，从图中可知该修饰电极对H2O2有较高的灵敏度，响应时间较快(5 s)。H2O2低浓度时的响应电流比较平坦，随着H2O2浓度的增大，响应电流增加幅度增大。H2O2浓度在0.8～1.8 mmol/L的范围内具有良好的线性关系(R2=0.992 2)，线性方程为i=-70.698C-28.863，其中i为响应峰电流，单位为μA；C为H2O2的浓度，单位为mmol/L。检测下限可达到0.2 mmol/L。

图8 优化条件下修饰电极对H2O2 的计时电流响应图Figure 8 Timing amperometric response of the modified electrode to H2O2 under optimal conditions.

2.5 电极的重现性与稳定性

用同一支电极对3.5×10-1mol/L的H2O2溶液连续测定20次，其电流响应相对偏差为2.3%，在同样条件下制备7支修饰电极，其电流响应的相对标准偏差为4.5%，表明Hemin/MWCNTs修饰电极对H2O2有较好的重现性。将电极置于H2O2(3.5×10-1mol/L)溶液中连续扫描100圈，峰电流仅下降5.2%，表明此电极具有良好的操作稳定性，试验后将电极置于4 ℃下悬于pH值为6.0的PBS上方保存，14 d内的电流没有明显变化，28 d后的响应电流为原来的89%，说明该电极具有较好的储备稳定性。

3 结论

利用Hemin与MWCNTs之间的π-π键作用，在超声分散下制备Hemin/MWCNTs纳米复合物；采用滴涂技术并在nafion的作用下将其固载在电极表面，制得一种全新的H2O2生物传感器(nafion/Hemin/MWCNTs/GCE)。实验表明，Hemin对H2O2具有较好的催化作用，MWCNTs的加入有效地增加了电极的比表面积，促进电子传递，提高电极的灵敏度。在检测中，该传感器表现出较好的稳定性、较低的检出限和较宽的检测范围。Hemin/MWCNTs所表现出的高稳定性和催化活性使其在各种生物传感器、生物电子器件以及催化剂等方面具有广泛的潜在应用前景。

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