分泌吲哚乙酸的蒌蒿内生耐镉细菌的筛选与鉴定

周小梅，赵运林，胥正钢，董萌，库文珍

分泌吲哚乙酸的蒌蒿内生耐镉细菌的筛选与鉴定

周小梅1，赵运林2*，胥正钢3，董萌1，库文珍1

1. 湖南城市学院建筑与城市规划学院，湖南 益阳 413000；2. 中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；3. 湖南农业大学生物安全科学技术学院，湖南 长沙 410128

从蒌蒿（Artemisia selengensis）体中分离分泌吲哚乙酸（IAA）的内生耐镉（Cd）细菌将有助于构建有效的植物-微生物联合修复体系。本研究以分泌IAA和Cd耐性为筛选指标，采用研磨法从蒌蒿的根、茎、叶中分离能产生IAA的内生耐Cd细菌，并对其铅（Pb）、铜（Cu）、锑（Sb）的耐受性及对蒌蒿生长特性的影响进行研究，根据形态特性、生理生化测定和16S rDNA序列分析对目标菌株进行分类鉴定。结果表明，从蒌蒿体内分离获得2株分泌IAA能力较强的内生耐Cd细菌J2和Y5，J2和Y5菌对Cd的耐受质量浓度均为90 mg·L-1，IAA的分泌量分别为23.108、15.192 mg·L-1；J2菌能明显增加蒌蒿的株高、最长根长、平均根长、鲜质量和干质量，Y5菌可显著提高蒌蒿的株高、鲜质量和干质量；J2和Y5菌对Pb的耐受质量浓度均为1200 mg·L-1，对Cu的耐受质量浓度分别为120和160 mg·L-1，对Sb的耐受质量浓度分别为50和150 mg·L-1；J2菌在LB平板上菌落为黄色、近圆形、粘稠，Y5菌在LB平板上菌落为白色、近圆形、湿润；J2和Y5菌的16S rDNA序列经扩增，分别获得1条大小约为1500 bp的条带，经比对分别与GenBank中Pantoea agglomerans STY29（HQ220151）、Pseudomonas fluorescens V7c10（KC195905）的相似性最高，结合形态特征与生理生化特性可分别鉴定为成团泛菌（Pantoea agglomerans）和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）。研究表明，从蒌蒿体中分离获得分泌IAA能力较强的内生耐Cd成团泛菌和荧光假单胞菌，为进一步研究其在蒌蒿修复Cd污染土壤中的作用奠定了基础。

蒌蒿；吲哚乙酸；内生耐镉细菌；筛选；鉴定

洞庭湖是我国第二大淡水湖泊，位于湖南省东北部，由于矿产资源的不合理开采及废物排放等因素导致其湿地土壤中重金属镉（Cd）污染严重（董萌等，2013a；Wang等，2008）。Cd为“五毒（Cd、汞（Hg）、铅（Pb）、铬（Cr）、砷（As））之首”，在土壤中长期积累不仅影响土壤的生态功能，而且还可通过食物链最终危害人类的身体健康（Chaney等，2004；崔岩山和陈晓晨，2010）。由于洞庭湖湿地面积辽阔，地形复杂，采用传统的物理、化学修复方法很难达到预期的修复效果，因此建立有效的植物-微生物联合修复体系具广阔的应用前景，该研究的重点是寻找富集植物及与其匹配的功能微生物。

蒌蒿（Aremisia selengensis）是菊科蒿属多年生草本植物，在洞庭湖湿地土壤中广泛分布，是洞庭湖湿地土壤的一种优势植物，对Cd具较强富集能力，是洞庭湖湿地Cd污染土壤的理想修复材料（董萌等，2011）。在Cd污染条件下蒌蒿的修复特性，防御机制和解毒机制已不乏研究（董萌等，2013b；董萌等，2013c），但由于蒌蒿生物量小等原因，限制了其在Cd污染土壤修复方面的应用。

研究表明，具重金属耐性的内生细菌可通过固氮作用（Lian等，2009；杨成德等，2014），分泌1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶（周佳宇等，2013；黄盖等，2013）、产生铁载体（高晓星等，2013；于婷等，2014）、分泌吲哚乙酸（IAA）（Zhang等，2010）和溶磷（Ma等，2009）等途径来改善植物的营养状况，进而提高植物的修复效果，而蒌蒿内生细菌的筛选及其对蒌蒿生长与修复功能的

影响研究却未见任何报道。

因此，本研究以分泌IAA及Cd耐性为指标筛选蒌蒿的内生细菌，并对菌株的Pb、铜（Cu）、锑（Sb）耐受性及对蒌蒿生长特性的影响等进行研究，从形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析等方面对目标菌株进行分类鉴定，以期为进一步揭示内生细菌在蒌蒿修复Cd污染土壤中的作用奠定基础，也为构建高效的蒌蒿-微生物联合修复体系打下理论基础。

1 材料与方法

1.1植物材料

蒌蒿于2012年5月采自南洞庭湖管竹山（112°19′33.4″E，28°55′14.9″N），装袋密封带回实验室备用。

1.2培养基

LB培养基（李振高等，2008）参照文献配制；有氮培养基（刘琳等，2010）用于分泌IAA菌株的筛选和IAA的定量测定。

1.3内生细菌的分离纯化

分别称取蒌蒿植株的根、茎、叶各1 g，自来水冲洗干净，依次使用体积分数为70%的酒精浸泡60 s，2.5%的次氯酸钠溶液表面消毒10 min，无菌水清洗4次。无菌条件下，将根、茎、叶放入无菌研钵中，加入适量无菌水和无菌石英砂，充分研磨，定容至10 mL。稀释成梯度稀释样品，分别从10-3、10-4、10-5稀释液中取100 μL涂布于Cd离子质量浓度为1 mg·L-1的LB固体培养基平板上，28 ℃倒置培养3 d，待长出菌落后挑取单菌落划线纯化。同时，将表面消毒的最后一次洗涤水涂布于LB平板上以检测植株样品表面消毒是否彻底。

1.4分泌IAA的内生耐镉细菌的筛选

以Cd离子质量浓度为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg·L-1的LB固体培养基为筛选培养基，接种后，28 ℃倒置培养3 d，观察Cd离子完全抑制菌株生长的最低浓度即最小抑制浓度（MIC），作为菌株对Cd耐受性的判断依据（潘风山等，2014）。分泌IAA菌株的筛选方法参照刘琳等（2010），将耐Cd菌株接种于有氮培养基中（每管4 mL，加入过滤除菌的L-色氨酸（质量浓度为2.5 mg·mL-1）1 mL），28 ℃，180 r·min-1摇床培养4 d，取菌液1 mL于灭菌的试管中，加入2 mL Sacowski显色液（250 mL去离子水+150 mL浓硫酸+7.5 mL物质量浓度为0.5 mol·L-1的FeCl3·6H2O）充分混合，室温下避光显色20 min，出现粉红色，说明有IAA产生。

1.5菌株分泌IAA的定量检测

培养条件同上，分泌IAA的内生耐Cd细菌经培养后10000 r·min-1离心10 min，取上清液加入等体积的Sacowski显色液（250 mL去离子水+150 mL浓硫酸+7.5 mL物质量浓度为0.5 mol·L-1的FeCl3·6H2O），室温下避光显色20 min，测定其OD530值。根据标准曲线计算内生细菌分泌IAA的量。

1.6菌株对Pb、Cu、Sb的耐受性测定

分泌IAA的内生耐Cd细菌分别接种于含Pb离子质量浓度为0、400、600、800、1000、1200、1500、2000 mg·L-1，Cu离子质量浓度为0、40、80、120、160、200 mg·L-1，Sb离子质量浓度为0、50、100、150、200 mg·L-1的LB固体培养基中，28 ℃培养3 d，观察Pb、Cu、Sb离子的MIC值以判断菌株的重金属耐受性（潘风山等，2014）。

1.7菌株对蒌蒿生长特性的影响

选取长势一致且带有4个芽的蒌蒿茎段若干，置于已过夜培养的菌悬液中30 min（对照置于无菌水中）后扦插于已灭菌处理且添加Cd离子质量分数为30 mg·kg-1的土样中，每处理扦插16株。常规养护60 d后统计蒌蒿植株的株高、鲜重、干重、最长根长和平均根长等指标。

1.8菌株的分类鉴定

形态学鉴定：分泌IAA的内生耐Cd细菌于LB平板上培养3 d，观察菌落的形态、光泽、质地、边缘特征、表面特征、隆起形状、透明度及菌落颜色等特征。

生理生化测定：甲基红（M.R.）、淀粉水解、柠檬酸盐利用、吲哚和V.P.等试验参照《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001）进行。

16S rDNA序列测定与分析：提取细菌DNA，选择通用引物FD1（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），RP2（5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）（廖丽，2012）。PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 25 μl，Primer FD1（10 μM）1.25 μL，Primer RP2（10 μM）1.25 μL，Template DNA 1.0 μL，H2O 21.5 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min；50 ℃退火1 min；72 ℃延长1.5 min；30次循环，72 ℃下延伸10 min后，取2 μL扩增产物于质量分数为1%琼脂糖凝胶上进行水平电泳，电泳条件为：5 v·cm-1，电泳缓冲液为TAE。PCR产物纯化及测序由上海美吉生物医药科技有限公司广州分公司完成。通过BLAST软件对所测序列进行相似性分析，MEGA5.1进行系统发育分析，首先用ClustalX1.81进行多序列匹配，Kimura 2-parameter计算进化距离，Neighbor-joining构建系统发育进化树，Bootstrap分析进化树分枝的稳定性，重复1000次。

2 结果与分析

2.1分泌IAA内生耐镉细菌的筛选

经分离纯化，从蒌蒿根、茎、叶中分离获得耐质量浓度为1 mg·L-1Cd离子的菌株共24株，采用不同Cd质量浓度梯度的LB培养基进行耐受性试验，筛选出6株Cd耐受能力较强的菌株，分别编号为T4、T7、T10、G5、J2、Y5，对Cd的耐受质量浓度均达到90 mg·L-1。从IAA的显色反应来看，6株菌株均能不同程度地分泌IAA，经定量测定，J2与Y5分泌IAA的能力较强（图1），可作为目标菌种进行下一步试验。

图1 菌株T4、T7、T10、G5、J2和Y5分泌IAA量的测定Fig. 1 Determination quantity of IAA-producing of strains T4, T7, T10, G5, J2and Y5

2.2菌株J2和Y5对重金属的耐受性

通过培养，发现菌株J2和Y5对Pb离子的耐受性相似，对Cu离子和Sb离子的耐受性均以Y5较强，其中对Sb离子的耐受浓度表现为Y5是J2的3倍（表1）。

表1 菌株J2和Y5对重金属离子的耐受质量浓度Table 1 The tolerance mass concentration of heavy metal ions of strains J2 and Y5 mg·L-1

2.3菌株J2和Y5对蒌蒿生长特性的影响

从表2可知，菌株J2和Y5侵染蒌蒿植株后，对蒌蒿的生长产生一定的影响，菌株J2可明显增加蒌蒿的株高、最长根长、平均根长、鲜重和干重，菌株Y5对蒌蒿的株高、鲜重和干重产生显著影响。

表2 菌株J2和Y5对蒌蒿生长的影响Table 2 Effect of strains J2and Y5on growth of Aremisia selengensis

2.4菌株J2和Y5的分类鉴定

菌株J2在LB平板上菌落为黄色，近圆形，边缘整齐完整，表面湿润，粘稠，与培养基结合紧密。菌株Y5在LB平板上菌落为白色，近圆形，边缘整齐完整，表面湿润透明，微隆起，与培养基结合紧密（图2）。

图2 菌株J2和Y5的菌落形态Fig. 2 Colony morphology of strains J2and Y5

M.R.、淀粉水解、柠檬酸盐利用等是细菌鉴定常用指标，J2、Y5菌生理生化特性的测定结果如表3，结合《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001）可知，J2、Y5菌生理生化指标的测定结果与成团泛菌（Pantoea agglomerans）和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）相一致。

表3 菌株J2和Y5的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strains J2 and Y5

16S rDNA基因序列可作为细菌系统发育分析鉴定最合适的指标（崔莹等，2014），本研究利用PCR方法对J2和Y5的16S rDNA进行了扩增，分别获得1条大小约为1500 bp的条带。PCR产物经纯化测序后（GenBank accession numbers：KJ882378、KJ882377），与GenBank 中相似度较高的菌株进行比对分析，并构建系统发育树。结果发现，菌株J2的16S rDNA序列与Pantoea agglomerans STY29（HQ220151）的相似度最高，Y5的16S rDNA序列与Pseudomonas fluorescens V7c10（KC195905）的相似度最高（表4，图3）。结合形态学和生理生化特性，J2与Y5菌可分别鉴定为成团泛菌（Pantoea agglomerans）和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）。

表4 菌株J2和Y5的16S rDNA序列相似性分析Table 4 Similarity analysis of 16S rDNA partial sequences of strains J2and Y5

3 讨论

内生细菌与植物的关系非常密切（马莹等，2013；刘莉华等，2013；姚领爱等，2010），两者联合作用可明显提高植物对重金属污染土壤的修复效果（Luo等，2012），其作用机制之一就是通过内生细菌分泌IAA来改善植物的营养状况，进而提高其修复效果（Maity等，2013）。刘佳等（2011）研究表明，分泌IAA的内生成团泛菌HAUM1能明显提高宿主水稻的生物量、叶绿素及磷含量。何琳燕等（2011）研究认为，在Cd污染条件下分泌IAA的龙葵内生细菌AR1、AY1能够明显促进油菜幼苗根的伸长。潘风山等（2014）研究显示，接种可产生IAA的内生细菌SaN1显著促进油菜植株的生长，提高植物对Cd的积累量。本研究以分泌IAA和Cd耐性为指标，从蒌蒿体内分离获得2株产生IAA能力较强的内生耐Cd细菌J2和Y5，J2和Y5菌能显著增加蒌蒿的生物量，表明J2和Y5菌能有效增加蒌蒿对Cd的实际积累量。

在重金属胁迫条件下，内生细菌往往可以同时耐受多种重金属污染，利用内生细菌的技术有望降低复合重金属污染对植物的毒性，提高植物对重金属的抗性（朱雪竹等，2010）。Abou-shanab等（2007）发现了多株可以同时耐受9种重金属毒性的内生细菌。Wei等（2009）从野生豆类根部分离到的土壤杆菌可以同时耐受Cd、Cu、锌（Zn）、Pb的毒性，并可促进植物生长。Idris等（2006）研究显示，从超积累植物体内筛选到的多株甲基营养菌能够耐受Cd、Zn、Cr、镍（Ni）、钴（Co）等多种重金属毒性。在本研究条件下，获得的内生细菌J2和Y5除对Cd具一定耐受性外，对Pb、Cu、Sb也具一定的耐受能力。南洞庭湖湿地土壤中Cd、Pb、Cu、Sb尤其是Cd、Cu、Sb含量远超过湖南省和中国的表土背景值（董萌等，2010）。因此，在南洞庭湖湿地土壤Cd、Pb、Cu、Sb的复合污染修复中菌株J2和Y5有望发挥其修复潜能。

目前已报道的能分泌IAA的内生细菌主要包括芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、泛菌属（Pantoea sp.）、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、伯克氏菌属（Burkholderia sp.）、土壤杆菌属（Agrobacterium sp.）等（黄盖等，2013；刘琳等，2010；潘风山等，2014；刘佳等，2011；何琳燕等，2011）。本研究获得2株分泌IAA能力较强的内生耐Cd细菌J2、Y5，经形态学观察、生理生化测定、16S rDNA序列测定与相似性分析可鉴定为成团泛菌（Pantoea agglomerans）和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）。这一方面说明了蒌蒿内生细菌具一定的种属多样性，同时也说明了泛菌属和假单胞菌属细菌分布广泛。进一步深入研究J2和Y5菌株对蒌蒿吸收、富集、转运和解毒Cd能力的影响，将为构建蒌蒿-微生物联合修复洞庭湖湿地Cd污染土壤的体系提供理论依据。

图3 菌株J2和Y5基于16S rDNA序列构建的系统发育树Fig. 3 Phylogenetic tree of strains J2and Y5based on 16S rDNA gene sequences

4 结论

以IAA的分泌能力和Cd耐受性为指标，从对Cd具较高富集能力的洞庭湖湿地植物蒌蒿体内分

离获得2株产生IAA能力较强的内生耐Cd细菌J2和Y5，J2、Y5菌对Cd的耐受质量浓度均达到90 mg·L-1，IAA的分泌量分别为23.108、15.192 mg·L-1，能显著促进蒌蒿的生长。经形态特性、生理生化测定和16S rDNA序列分析可分别鉴定为成团泛菌（Pantoea agglomerans）和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）。J2和Y5对Pb、Cu、Sb也具一定的耐受性，在南洞庭湖湿地土壤Cd、Pb、Cu、Sb的复合污染修复中有望发挥其修复潜能。成团泛菌和荧光假单胞菌分布较为广泛，进一步深入研究J2和Y5菌对蒌蒿修复Cd污染土壤的影响，为构建蒌蒿-微生物联合修复体系打下理论基础。

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Screening and Identification of Indole Acetic Acid-Producing Cadmium-Resistant Endophytic Bacteria from Artemisia Selengensis

ZHOU Xiaomei1, ZHAO Yunlin2*, XU Zhenggang3, DONG Meng1, KU Wenzhen1
1. College of Architecture and Urban Planning, Hunan City University, Yiyang 413000, China; 2. Central South University of Forestry Science and Technology, Changsha 410004, China; 3. College of Bio-safety Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

To isolate indole acetic acid (IAA)-producing cadmium-resistant endophytic bacteria from Artemisia selengensis is to help build an effective combined remediation system of plant and microorganism. Using IAA-producing and cadmium-tolerance as the screening indexes, isolated IAA-producing cadmium-resistant endophytic bacteria from the root, stem and leaf of Artemisia selengensis by the grinding method, and determinated the tolerance of lead, copper, antimony and the effect of the strains on growth of Aremisia selengensis. Strains were identified based on morphological, physiological and biochemical properties as well as 16S rDNA sequence analysis. The results showed that, two cadmium-resistant endophytic bacteria which both have strong abilities to secrete IAA, named as J2and Y5,were isolated from Artemisia selengensis. The cadmium tolerance mass concentration of strains J2and Y5were up to 90 mg·L-1. The IAA production of strains J2and Y5respectively were 23.108 mg·L-1, 15.192 mg·L-1. Strain J2could significantly increase the plant height, the longest root length, the average root length, the fresh weight and the dry weight of Artemisia selengensis; strain Y5could significantly improve the plant height, the fresh weight and the dry weight of Artemisia selengensis. The lead tolerance mass concentration of strains J2and Y5were up to 1200 mg·L-1, while the copper tolerance mass concentration of strains J2and Y5respectively were 120 mg·L-1and 160 mg·L-1, the antimony tolerance mass concentration of strains J2and Y5respectively were 50 mg·L-1and 150 mg·L-1. The colony of strain J2was yellow, suborbicular and sticky on LB tablet. The colony of strain Y5was white, suborbicular and moist on LB tablet. Strains J2and Y5respectively obtained one about 1500 bp band by amplifying 16S rDNA sequences, and by comparing strains J2and Y5showed the closest similarity of 16S rDNA sequences to Pantoea agglomerans STY29(HQ220151) and Pseudomonas fluorescens V7c10(KC195905) respectively in GenBank and thus were identified as Pantoea agglomerans and Pseudomonas fluorescens respectively in combination with morphological, physiological and biochemical properties. This research on IAA-producing cadmium-resistant endophytic bacteria of Pantoea agglomerans and Pseudomonas fluorescens isolated from Artemisia selengensis provided a theoretical framework for studying their roles in remedying cadmium contaminated soil of Artemisia selengensis.

Artemisia selengensis; indole acetic acid; cadmium-resistant endophytic bacteria; screening; identification

X172

A

1674-5906（2014）12-1980-06

国家林业公益性行业科研基金项目（201304310）；湖南省自然科学基金项目（2015JJ4012）；湖南省科技计划项目（2010SK2004）；湖南省教育厅项目（13C118）

周小梅（1977年生），女，副教授，博士，主要研究方向为环境污染生态修复。E-mail:864759100@QQ.com

*通信作者：赵运林，男，E-mail:zyl8291290@163.com

2014-08-17

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