糖尿病大鼠肺脏微循环通透性的变化及其意义

彭丽媛 王海澜（等）

[摘要] 目的 观察实验性糖尿病大鼠肺脏微血管通透性的变化，为临床提供糖尿病肺病的形态学依据。 方法 雄性SD大鼠共60只，体重（220±20）g，按65 mg/kg的剂量一次性腹腔注射链脲菌素（STZ）来制备糖尿病大鼠模型，在成模即刻（0周）、成模后2、4、8、12周时分别随机抽取12只，通过干湿重法、尾静脉注入伊文思蓝（EB）并心脏灌注后在分光光度计下测肺组织OD值以及荧光显微镜下测其荧光量来了解肺脏微血管的通透性。另随机抽取12只大鼠作为正常组。 结果 ①与正常组比较，0周组、2周组糖尿病大鼠肺组织的干湿重稍有增加，但差异无统计学意义（P > 0.05）。而4周组、8周组和12周组糖尿病大鼠出现了组织干湿重明显增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。②与正常组相比较，0周组、2周组糖尿病大鼠肺组织EB含量稍有增加，但差异无统计学意义（P > 0.05）。从4周开始，糖尿病大鼠出现肺组织EB含量明显增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。③荧光显微镜下观察肺腑组织荧光量可见4、8、12周组大鼠肺脏组织出现较强的红色荧光。 结论 糖尿病导致大鼠肺脏微血管通透性发生了变化。

[关键词] 糖尿病；糖尿病肺病；微循环障碍；伊文思蓝；通透性

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）01（c）-0023-04

Changes in microvascular permeability of lung in experimental diabetic rats and its significance

PENG Liyuan1 WANG Hailan1 ZHAI Fanglong1 XIE Zaiming1 WANG Mingjun2

1.Affiliated Shenzhen Longgang Central Hospital of Zunyi Medical College， Guangdong Province， Shenzhen 518116， China； 2.Shenzhen Children's Hospital， Guangdong Province， Shenzhen 518000， China.

[Abstract] Objective To observe the changes of microvascular permeability of lung in experimental diabetic rats， and to offer clinical morphologic data for diabetic pulmonary disease. Methods 60 male SD rats with （220 ±20） g were selected and injected with Streptozotocin （STZ） intraperitoneally at a dose of 65 mg/kg body weight to make experimental DM rat models. Then respectively， 12 of them were randomly selected at 0， 2， 4， 8， 12 weeks to measure their dry weight and wet weight of lung tissues. Also， the OD values were observed through spectrophotometer and the amount of fluorescence by a fluorescence microscope after the rats were injected Evans blue （EB） into tail vein. Another 12 rats were randomly selected as normal group. Results ①The difference of lung tissue wet-dry weight among normal group and 0 week group， 2 weeks group was not statistically significant （P > 0.05）. The lung tissue wet-dry weight in 4 weeks group， 8 weeks group， 12 weeks group were all higher than those in normal group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. ②The difference of lung tissue EB content among normal group and 0 week group， 2 weeks group was not statistically significant （P > 0.05）. The lung tissue EB content in 4 weeks group， 8 weeks group， 12 weeks group were all higher than those in normal group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. ③And expression strong red fluorescence was found in the lung tissue of 4 weeks， 8 weeks， 12 weeks group through the fluorescence microscopy. Conclusion Diabetes leads to the changes of lung microvascular permeability in rats.

[Key words] Diabetes； Diabetic pulmonary disease； Microcirculatory disturbance ； Evans blue； Permeability

糖尿病的患病率日益增加，它可使心血管、肾、视网膜、神经等全身多个组织器官的结构与功能发生变化，由于它的致残、致死性并发症，目前已成为全球最关注的健康问题之一。20世纪70年代，Yeh等[1]首次提出肺脏可能是糖尿病的靶器官之一。糖尿病引起肺脏损害的假设在之后的国内外研究中得到了肯定[2-3]，并且也越来越受到人们的重视。然而到目前为止，糖尿病引起肺功能损害的原因仍未完全明确。糖尿病对心血管、肾、视网膜、神经等组织器官损害的基础病变是糖尿病微血管病变，而肺组织存在着丰富的结缔组织和血管系统，因此肺部微血管改变亦是糖尿病肺脏损害的病理基础，故而设计了本课题，旨在为临床提供糖尿病肺病的形态学依据，也为临床上预防和治疗糖尿病肺病提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物

选用健康雄性SD大鼠，体重200～240 g，平均（220±20）g，共72只，购于广东省动物实验中心，大鼠适应性喂养1周，动物房采用昼夜交替，时间为12 h/12 h，保证室内温度（22±2）℃，严格遵照遵义医学院的实验室管理制度要求。

1.2 药品与仪器

链脲菌素（STZ）：美国Sigma公司，cas 18883-66-4，由上海宝曼生物公司提供；多聚甲醛、伊文思蓝（Evans blue，EB）、甲酰胺均由上海宝曼生物公司提供。血糖仪及试纸、电子天平、平头针、头皮针、输液架、自动脱水机、自动包埋机、离心机、石蜡切片机、恒温水浴箱、烤箱、722分光光度计、荧光显微镜、大鼠固定器。

1.3 方法

1.3.1 实验性糖尿病大鼠模型的制备

健康雄性SD大鼠适应性喂养1周后，禁食不禁水12 h，以65 mg/kg的剂量经腹腔一次性注入新鲜配制的STZ溶液来制备糖尿病模型。72 h后，采取尾静脉取血测血糖，血糖>16.7 mmol/L则入选为糖尿病模型。正常组的大鼠则腹腔内注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。成模后大鼠给予自由饮食，不用任何药物干预。

1.3.2 实验动物的分组

SD大鼠中随机选取12只作为正常组，腹腔注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；为防止大鼠造模失败及实验过程中死亡而造成的数据缺失，实验组大鼠的实际数量为67只，将它们全部造模后剔除造模不成功的大鼠，造模成功的大鼠则继续饲养，在0、2、4、8、12周时间点，分别随机选取12只作为该组的实验动物。各个实验组再随机分为两个区组，区组1的大鼠行心脏灌注，取下肺组织称其干湿重；区组2大鼠则尾静脉注入伊文思蓝，循环1 h后行心脏灌注，再在分光光度计下测肺组织的OD值、制作石蜡切片后在荧光显微镜下观察其荧光量。

1.3.3 干湿重法测肺脏组织的含水量

麻醉成功后，将大鼠仰卧固定于实验台上，心脏灌注生理盐水直至右心房流出液呈无色、肺脏变白、肝脏和肾脏变裸色、可视血管均呈白色为止，再灌注室温4%多聚甲醛60 mL，直至大鼠身体变硬为止。取下肺组织，称其湿重。再置于58℃烘箱中烘烤72 h至恒重，称其干重。按Elliot公式计算每毫克肺组织的含水量：肺组织含水量=（湿重-干重）/湿重×100%，用组织含水量的差异来表示肺微血管通透性的变化。

1.3.4 伊文思蓝灌注法测肺组织微血管的通透性

1.3.4.1 肺组织EB含量的测定

1.3.4.1.1 绘制标准曲线 取1mg EB置于EP管中，加甲酰胺至10 mL，混匀后从中取出0.8 mL置于EP管中，再加甲酰胺至10 mL，此作为第1管，此时其浓度为8 μg/mL；从第1管中取5 mL，加入甲酰胺至10 mL，作为第2管，其浓度为4 μg/mL；再从第2管中取5 mL加入甲酰胺至10 mL，作为第3管，浓度为2 μg/mL……照此类推，共9管。将各管液体置于50℃水浴箱48 h后，以甲酰胺作为空白对照溶液，用722 N可见分光光度计在620 nm处测定各管溶液的吸光度（即OD值），从而计算出回归方程：Y=22.938X-0.1066，（R2 = 0.999）。见图1。

图1 EB标准曲线

1.3.4.1.2 EB含量的测量 参照相关文献方法[4]，大鼠经尾静脉以1.5 mL/kg的浓度注入3%EB溶液，循环1 h后，麻醉、心脏灌注，取下左肺组织，称重，置入3 mL甲酰胺溶液中，在50℃恒温水浴箱中孵育48 h以使肺组织中的伊文思蓝充分溶解在甲酰胺中，再以4000 r/min的速度离心20 min。取上清液，722分光光度计下测肺组织的OD值，在标准曲线上计算出每份肺组织的EB浓度。再将它与质量相比，可得每克肺组织的EB量，即：每克肺组织EB量（μg/g）=EB浓度（μg/mL）×3 mL/重量（g）。

1.3.4.2 石蜡荧光

如前所述，参照文献方法[5]，尾静脉注入EB循环1 h后，麻醉大鼠，行心脏灌注，取下右肺组织后置于4%多聚甲醛溶液中固定12 h，自动脱水机脱水并自动包埋机包埋后再制成石蜡病理切片（防脱玻片），烤片2.5 h，置梯度酒精脱蜡、水化，直接甘油封片，立即在荧光显微镜绿色激发光下观察EB在肺组织中的分布。相同曝光条件下，拍照记录。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 糖尿病模型制备的结果