开启显微成像的“纳米时代”

2014-02-20孙育杰

大众科学 2014年11期

文- 孙育杰

今年诺贝尔化学奖三位获奖人，打破了光学成像中长期存在的衍射极限，将荧光显微成像的分辨率带入“纳米时代”，为生命科学研究带来巨大变化

10月8日，2014 年诺贝尔化学奖授予了美国科学家埃里克·白兹格（Eric Betzig）、威廉姆·莫纳（William Moerner）和德国科学家施泰方·海尔（Stefan Hell），以表彰他们在超高分辨率荧光显微技术领域的贡献。正如官方颁奖文中描述，这类技术从方法实现到在科学研究中大展身手虽然不过十几年时间，但已对多个领域产生显著推动，并且可以预言在未来将给生命科学研究带来巨大的变化。

诺贝尔化学奖评选委员会在当天的声明中说，长期以来，光学显微镜的分辨率被认为不会超过光波波长的一半，这被称为“阿贝分辨率”。借助荧光分子的帮助，今年获奖者们的研究成果巧妙地绕过了经典光学的这一“束缚”，他们开创性的成就使光学显微镜能够窥探纳米世界。如今，纳米级分辨率的显微镜在世界范围内广泛运用，人类每天都能从其带来的新知识中获益。

诺贝尔化学奖评选委员会还指出，得奖者的研究允许人类观察病毒以至细胞内的蛋白质，对了解有关物质的功能作出重大贡献，例如可用于观察帕金森症、脑退化症和亨廷顿病患者体内的蛋白变化等。

埃里克·贝齐格

斯特凡·黑尔

威廉·莫纳

打破衍射极限

我们人眼一般最小能看见大约0.1毫米的东西，而生物的基本单元——细胞的直径平均约为20微米或0.02毫米，所以对生物微观世界的观察需要使用光学显微镜。光学显微技术有很多优点，不但能放大微观世界，同时还对样品没有损害，并且可以特异地观察目标对象。这种特异性一般是通过荧光显微技术实现的。荧光是物质吸收光照后发出的光，一般发射光波长比吸收光波长更长，因此可以单独检测荧光，对目标实现高灵敏度的检测。

然而，光学显微镜的分辨率是有限的。由于光的衍射，即使一个无限小的光点在通过透镜成像时也会形成一个弥散图案，俗称“艾里斑”。这样即便两个物点相距较远，其弥散斑却可能很近，以致无法区分。

基于此原理，早在1873年，德国科学家恩斯特阿贝（ErnstAbbe）提出阿贝光学衍射极限，并作为重要成就刻于其墓碑上。根据这一极限，光学显微镜的分辨率约为检测光波长的一半，300纳米左右（可见光的波长为400～700纳米），或是我们头发直径的1/300。超高分辨率荧光显微技术通过一系列物理原理和化学机制“打破”了这一衍射极限，把光学显微镜的分辨率提高了几十倍，使我们以前所未有的视角观察生物微观世界。

探测微观世界

发展超高分辨率荧光显微技术，对生物学研究意义非常重大。

目前的超高分辨率荧光显微技术大体分为三类：受激发射损耗、结构光照明技术和单分子技术。其历史可以追溯到上个世纪80年代。这次获得诺贝尔化学奖的三位科学家是这个方向的先驱人物。

1994年，此次获奖的德国科学家施泰方·海尔当时还是博士后，他最先提出用受激发射损耗的方法（简称STED）打破光学衍射极限，并最终在2000年的实验中得以实现。

STED方法利用了类似于产生激光的受激辐射原理，将一束形似于面包圈的激光光斑套在用于激发荧光的激光光斑外，这个面包圈激光可以抑制其区域内荧光分子发出荧光，这样通过不断缩小面包圈的孔径就可以获得一个小于衍射极限的荧光发光点，并通过扫描实现超高分辨率的图像，将光学显微镜分辨率提高了近10倍。

施泰方·海尔现为德国哥根廷大学教授和德国马克斯·普朗克生物物理化学研究所所长。从2000年开始，他不断改进STED技术，使其更加适用于生物研究。另外，他还通过相似原理发明了一系列的超高分辨率技术，统称为可逆饱和荧光跃迁（RESOLFT），为超分辨率荧光显微成像技术的发展做出了巨大贡献。

基于结构照明原理的超高分辨率技术是美国科学家麦茨·古塔弗森（MatsGustafsson）在2000年发明的，非常适于细胞研究，可惜分辨率只提高了一倍。这个技术基于两个高空间频率的图案重叠可以形成低频率莫尔条纹的原理，通过解析莫尔条纹实现超高分辨率成像。可惜古塔弗森于2011年51岁时因癌症去世，英年早逝，无缘分享这次的诺贝尔奖。

超分辨荧光显微镜技术真正成熟并得以在生物研究中广泛应用，是2006年同时出现的两种基于随机重构原理的超高分辨率光学成像技术。当时是由哈佛大学庄小威教授（随机光学重构显微术STORM技术）、埃里克·贝齐格（光活化定位显微术PALM技术）及萨缪尔·海斯（SamuelHess，荧光活化定位显微术fPALM技术）三个研究组分别同时独立发明的。它们的原理非常像，都是基于荧光分子的光转化能力和单分子定位，通过用光控制每次仅有少量随机离散的单个荧光分子发光，并准确定位单个荧光分子艾里光斑的中心，把多张图片叠加形成一幅超高分辨率图像。

STED显微技术的原理

这种“以时间换空间”的思路非常巧妙，把荧光成像的分辨率一下子提高了20倍左右。

这次获奖的威廉·莫纳现为美国斯坦福大学讲座教授，是单分子荧光技术的先驱人物。1989年，他任职于美国IBM研究中心时在世界上首次实现了单个分子的光吸收的测量。1997年，他与因为绿色荧光蛋白获得2008年诺贝尔化学奖的钱永健合作发现了绿色荧光蛋白的光转化效应。

而埃里克·白兹格是美国霍华德·休斯医学研究所的教授，是荧光显微技术领域的领军人物。他最早在1992年就实现了近场超高分辨率荧光成像，其后在1994年提出了基于单分子信号实现超高分辨率成像的思想，并于2006年在实验中得以实现。

值得指出的是庄小威教授作为STORM超分辨技术的发明人，其研究团队一直领导并推进着超高分辨率显微技术的发展和应用，是近8年来这个领域最活跃的研究团队。

超高分辨率成像作为一类很新的技术，突破了光学成像中的衍射极限，把传统成像分辨率提高了10～20倍，好比一个近视眼的人突然戴上了合适的眼镜，这一技术因此成为研究细胞结构的利器。

过去七八年间，超高分辨率成像技术不断推进，先后实现了多色、三维和活细胞高速成像。其生物应用也很广泛，包括细胞膜蛋白分布、细胞骨架、线粒体、染色质和神经元突触等。超高分辨率技术一经出现就引起广泛关注，先是在2006年被世界著名《科学》期刊评为年度十大技术突破，接着被生物医学方法学最好的期刊《自然-方法》评为2008年度方法。在近期《自然-方法》十周年特刊评出的10年10大技术中，超高分辨率成像和单分子技术也都位列榜中。