茴香成熟叶柄石蜡切片技术的研究

陈土娟，黄子娟，潘海玉，陈佳敏，王 琼，郭克婷，潘春香

茴香成熟叶柄石蜡切片技术的研究

陈土娟，黄子娟，潘海玉，陈佳敏，王 琼，郭克婷，潘春香*

（韶关学院英东农业科学与工程学院，广东韶关512005）

石蜡切片技术是一项基础的实验技术，在具体操作过程中仍经常在的裂纹、皱缩、不粘片、脱落、薄厚不匀等问题.且不同作物，同一种作物不同器官，同一器官不同发育阶段，每一环节所采取的方法不同，在实际操作工程中均不能照搬实验指导或者文献，而需要进行反复摸索才可以制得一个理想的片子.实验以小茴香成熟叶柄为材料，通过大量的摸索性试验，成功制得了小茴香成熟叶柄的永久性石蜡片子，明确了叶柄的内部组织构造，提出了取材与固定、脱水与透明、浸蜡与包埋、染色、切片、粘片等关键环节的适宜操作方法，提高了制片效率和成功率，为利用石蜡切片技术进行科研和教学的工作人员提供参考.

茴香；成熟叶柄；石蜡切片

石蜡切片技术因其具有经济、方便、适用、简便、易操作、设备要求不高、可长期保存等优点而在组织学和病理学常规制片技术中成为最为广泛的应用.它在植物的科学技术研究领域扮演着十分重要的角色.但是，在石蜡切片制作仍然存在切片不成带、弯曲、出现裂纹、皱缩、不粘片、脱落、薄厚不匀等诸多问题，且不同作物，同一种作物不同器官，同一器官不同发育阶段，每一环节所采取的方法不同，在实际操作工程中均不能照搬实验指导或者文献，而需要进行反复摸索才可以制得一个理想的片子.因此，针对石蜡存在的问题，有过很多探讨和改良.有针对不同植物的研究，如玉米成熟期茎秆［1］、水稻籽粒胚乳［2］、大豆茎顶端分生组织［3］、蕨类植物［4］、白头翁花［5］、杏花芽［6］、桦树松萝［7］、粳稻颖果［8］、含羞草［9］等.也有针对石蜡切片技术改良进行研究的，如候春春经过总结和自己实践提出了试验药剂、时间和温度是三大关键因素［10］；杨捷频提出了一些能缩短实验周期，解决实验有毒物质二甲苯污染的方案［11］；从载玻片、盖玻片的处理，浸蜡与包埋，染色液的配制，展片、粘片、烘片进行了探索，提出了染色效果好、组织不脱落的关键技术［12］；江虹针对切片不成带、切片弯曲、切片裂纹、厚薄不匀、皱缩、粘刀、脱落、灰染、着色不匀、褪色、封固不良等问题进行了探索，并提出了解决措施［13］；赵俊对石蜡的精炼、取材与固定、脱水、透明、浸蜡包埋、切片、展片、粘片、脱蜡复水及染色、中性树胶封藏几个方面探讨了植物石蜡切片技术［14］.本文以内蒙古小茴香叶柄为材料，对其石蜡切片技术的取材、固定、洗涤、脱水、包埋、切片、粘片、脱蜡、染色、脱水、透明和封胶等一系列环节进行了试验和总结，提出了取材与固定、脱水与透明、浸蜡与包埋、染色、切片、粘片等关键环节的适宜方法，以提高制片效率和成功率，为石蜡切片技术在植物解剖学上的应用提供参考.

1 材料与方法

1.1实验材料

选择内蒙古小茴香叶柄为材料，切成大约长度3～5 mm茎段，立即放入FAA固定液中固定，抽气后放置4℃冰箱贮存.

1.2 试验方法

小茴香于2013年3月播种于韶关学院英东农业科学与工程学院C座楼顶大棚花盆中，取成熟的叶柄作为材料.切片在韶关学院英东农业科学与工程学院植物学实验室进行.实验在传统的石蜡包埋技术的基础上，根据小茴香成熟叶柄的结构特点，对脱水、透明、透蜡、包埋、染色、切片、粘片、脱蜡、封片等步骤进行了改进.实验用德国徕卡半薄切片机切片，德国莱卡LEICA DM LS2显微镜观察，Nikon COOLPIX4500数码相机进行显微成像.

（1）取材与固定：材料在低温的条件下(保温材料的盒子里面装冰块)取，且迅速固定.分割材料要快、准，分割长度为3～5 mm.固定用医用青霉素小瓶，每个小瓶中放置3～4段材料，固定24 h.

（2）脱水与透明：脱水与透明，时间是关键，而且脱水与透明二者密切相关.脱水越充分，透明所需的时间就越短.实验采取脱水透明均为1.5 h.

（3）染色：染色在1/2纯酒精+1/2纯二甲苯透明时间加入效果最好.染色剂量以1～2滴为宜.

（4）包埋：石蜡选择与精炼石蜡质地是石蜡切片中最为关键的一步.以54～56，熔点53～57规格的石蜡包埋效果好.煮蜡用75℃恒温水浴进行多次熔蜡换杯.竖立材料包埋中竖立材料的过程也是比较难的一步.采用制冷台方法.具体为：先将两条玻璃（当成致冷台）放到凉水中浸凉备用，然后将蜡杯中的组织与蜡液全部倒入纸船，摆好材料的位置，再将纸船放到浸过凉水的玻璃块上，迅速将已经摆好的材料竖立起来.

（5）切片、粘片与脱蜡：夏天高温季节切片之前，先将蜡块放入冰箱中冰冻一会，保持石蜡的硬度；当室内干燥时，在旁边放一盆温水增加室内湿度.粘片采用捞片法.即：将切好的片子放到40℃左右的温水上，使切片展开，然后用载玻片将蜡片捞起，并吸掉多余的水分，放到40℃烘箱中烘干.捞片法会带有许多水分，一般需要烘1 h以上或更长时间.脱蜡的时间长短与气温有关.夏天高温时，时间可以短一点，每一步骤3～5 min；冬季低温时，可延长时间，或提高室温.

（6）溶液换置与封片：脱蜡、染色、脱水透明过程所用的溶液在重复用过3～4遍后，要更换溶液.通常二甲苯里进入水分后，二甲苯溶液会出现白色浑浊或水珠状的悬浮物，因此，二甲苯溶液需要更换.封片要湿封.即先将胶液滴在组织的边缘位置，然后将盖玻片倾斜盖在胶液上，再缓慢将胶液轻轻压至组织上，让其自然风干.

2 结果与分析

2.1茴香叶柄石蜡包埋制片方法

针对茴香叶柄结构特点及石蜡包埋制片方法中存在的问题，通过大量摸索性试验，得到了适合茴香成熟叶柄的石蜡切片方法，同传统石蜡切片法相比，在固定、石蜡选择、石蜡精炼、脱水、透明、染色、包埋、切片、粘片、脱蜡、封片等方面进行了改进，提高了制片效率.

（1）脱水与透明.明确了脱水时间与透明时间的相关性，即脱水时间越长，透明时间就越短，本实验脱水2 h，透明为1.5 h.

（2）染色.传统染色方法是在70%酒精脱水时加入染色剂.但实际操作过程中，即使是放置一个晚上，已染色的材料也会在后续逐级高浓度的酒精中被冲洗掉，最后几乎全部脱色.本实验摸索出在1/2纯酒精+ 1/2纯二甲苯透明时间加入染色剂效果最好.

（3）石蜡选择与精炼.实验对比了规格52～54，熔点51～55和规格54～56，熔点53～57两种石蜡的包埋效果，筛选出规格54～56，熔点53～57规格的效果较好.煮蜡用75℃恒温水浴进行多次熔蜡换杯为宜.

（4）竖立材料.竖立材料使石蜡切片中难以操作的一步.通常采用冷水中放置纸船的方法，但在实际操作过程中存在难以竖立、组织与石蜡分离等现象.本实验采用的制冷台方法，效果很好.

（5）切片、粘片和脱蜡切片与室内温度密切相关.夏天操作时容易出现组织压缩，切片皱褶不易展开之现象.本实验摸索出夏天高温季节切片之前，先将蜡块放入冰箱中冰冻一会，保持石蜡的硬度；同时，当夏季室内干燥，蜡片受静电影响卷片，不能形成连片时，在旁边放一盆温水增加室内湿度可一切出较好的片子.传统方法是用加热展开的方法，即在粘片时，滴一滴蒸馏水在载玻片上，再取切片，浮置水面上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度.最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入30～40℃温箱中约24 h烘干.

本研究的改良方法为捞片法，即用将切好的片子放到40℃左右的温水上，使切片展开，然后用载玻片将蜡片捞起，并吸掉多余的水分，放到40℃烘箱中烘干.捞片法会带有许多水分，一般需要烘1 h以上或更长时间.脱蜡的时间长短与气温有关.夏天高温时，时间可以短一点，每一步骤3～5 min；气温较低的冬天时，要延长时间，甚至提高室温，否则蜡不容易被脱去，从而影响后续的步骤.

（6）溶液换置和封片.一般脱蜡、染色、脱水透明过程所用的溶液在重复用过3～4遍后，就要更换溶液.如果有水分进入二甲苯，二甲苯溶液就会出现白色浑浊甚至出现水珠状的悬浮物质，经过染色的载玻片逐级放入其他溶液缸中的时候，也会导致其他缸中的溶液变色.一般，观察其颜色变化的深浅来断定是否该换其溶液.

通常封片前切片在空气中放置时间太长，二甲苯挥发，不仅使封片剂难以进入组织间隙，而且切片中易出现类似色素样的点状结晶和像核一样的黑色圆斑.封片用的是中性树胶.我们摸索出的方法为：湿封.即先将胶液滴在组织的边缘位置，然后将清洗干净的盖玻片的倾斜盖在胶液上，再缓慢地将胶液轻轻压至组织上，最好选用稀一点的胶液.封好片贴上标签，让其自然风干.

2.2小茴香叶柄石蜡包埋制片效果

小茴香叶柄的石蜡包埋切片组织完整、清晰、染色均匀，如图1所示.叶柄是叶片与茎的连接部分，主要起输导和支持作用.叶柄具有与茎相连的维管束，是叶片与茎之间的物质运输的通道.叶柄由外到内由表皮、厚壁细胞、皮层、维管束、髓腔组成.表皮细胞近似长方形，排列紧密.厚壁细胞是具有由初生壁和次生壁组成的细胞.维管束形成中可见初生韧皮部，初生木质部，初生木质部10束，呈发散型分布.初生木质部的外面是初生韧皮部.叶柄中间髓部为空腔，被周围薄壁细胞围绕，沿着维管束延伸，形成叶柄内的气道.

图1 小茴香叶柄横切面图

3 讨论

关于小茴香植物组织构造方面的研究报道较少.潘春香等研究了内蒙古茴香与“油茴1号”茴香根、茎的解剖结构，该研究重点揭示了2个品种根、茎的基本组织结构及其区别，而未总结和提出其相关的石蜡包埋技术的具体改进［15］.本实验在对叶柄基本组织构造进行观察的同时，重点研究总结了成熟叶柄的石蜡包埋技术.

小茴香叶柄由外到内由表皮、厚壁细胞、皮层、维管束、髓腔组成.表皮细胞近似长方形，排列紧密.厚壁细胞是具有由初生壁和次生壁组成的细胞.维管束由初生韧皮部和初生木质部组成，有10束，呈发散型分布.初生木质部的外面是初生韧皮部.叶柄中间髓部为空腔，被周围薄壁细胞围绕，沿着维管束延伸，形成叶柄内的气道.外层细胞排列致密、木质化程度高、内部细胞疏松、组织较软.针对成熟期小茴香成熟叶柄的结构特性，在传统石蜡包埋的基础上，在固定、石蜡选择、石蜡精炼、脱水、透明、染色、包埋、切片、粘片、脱蜡、封片等方面进行了改进，提高了制片效率.

具体改进方法为：脱水2 h、透明1.5 h；染色是在1/2纯酒精+1/2纯二甲苯透明时间加入染色剂；石蜡选择规格为54～56，熔点53～57的；煮蜡用75℃恒温水浴进行多次熔蜡换杯为宜；竖立材料制冷台方法，即先将两条玻璃（当成致冷台）放到凉水中浸凉备用，然后将蜡杯中的组织与蜡液全部倒入纸船，摆好材料的位置，再将纸船放到浸过凉水的玻璃块上，迅速将已经摆好的材料竖立起来；切片在夏天高温季节切片之前，先将蜡块放入冰箱中冰冻一会，保持石蜡的硬度；同时，当室内干燥时，在旁边放一盆温水增加室内湿度；粘片为捞片法，即用将切好的片子放到40℃左右的温水上，使切片展开，然后用载玻片将蜡片捞起，并吸掉多余的水分，放到40℃烘箱中烘干.捞片法会带有许多水分，一般需要烘1 h以上或更长时间；脱蜡的时间长短与气温有关.夏天高温时，时间可以短一点，每一步骤3～5 min；气温较低的冬天时，要延长时间，甚至提高室温，否则蜡不容易被脱去，从而影响后续的步骤；溶液换置一般脱蜡、染色、脱水透明过程所用的溶液在重复用过3～4遍后，就要更换溶液.如果有水分进入二甲苯，二甲苯溶液就会出现白色浑浊甚至出现水珠状的悬浮物质，经过染色的载玻片逐级放入其他溶液缸中的时候，也会导致其他缸中的溶液变色.一般，观察其颜色变化的深浅来断定是否该换其溶液；封片为湿封.即先将胶液滴在组织的边缘位置，然后将清洗干净的盖玻片的倾斜盖在胶液上，再缓慢地将胶液轻轻压至组织上，最好选用稀一点的胶液.封好片贴上标签，让其自然风干.

石蜡切片技术简单易行，但要想切出一个好的片子却绝非易事，需要针对具体材料、药剂、设备、操作环境等情况进行长时间的摸索和总结.希望本研究能为石蜡切片技术操作者提供参考.

［1］李素坤，张秋芝，郝玉兰，等.玉米成熟期茎秆石蜡切片方法的研究［J］.安徽农业科学，2010，38(8):3935-3937.

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［3］李晓梅.大豆茎顶端分生组织石蜡切片的制备［J］.大豆科学，2008，28(4):708-710.

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［5］王金平，张俊梅.白头翁花的石蜡切片制作［J］.信阳师范学院学报:自然科学版，2008，21(4):573-576.

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［9］赵云，李涛，陈增洁.含羞草石蜡切片的制作［J］.宁夏农林科技，2011，52(4):45-46.

［10］侯春春，徐水.浅析影响石蜡切片质量的关键因素［J］.中国农学通报，2009，25(23):94-98.

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Research on plant paraffin section technology on mature petioles of fennel

CHEN Tu-juan，HUANG Zi-juan，PAN Hai-yu，CHEN Jia-min，WANG Qong，GUO Ke-ting，PAN Chun-xiang*
(Yingdong College of Agricultural Science and Engineering,Shaoguan University，Shaoguan 512005,Guangdong，China)

Paraffin section technology is the most basic experimental technology，but problems of cracking，shrinking，non-sticking to slides，exfoliation and uneven thickness still exist in the process of operation. Meanwhile，the methods are differently used on different plants，different organs of same plant and different growth stage of same organ，so it is unreasonable to copy the methods listed in experiment guidance or reference.An ideal slide only can be obtained through trial and error.This experiment applies the mature petioles of fennel as experimental material，and through this experiment it successfully obtain the permanent paraffin slide of fennel’s mature petioles through trial and error and make clear the internal organizations and structures of the petioles.Additionally，it also figured out some appropriate operating methods in some key procedures，such as sampling and fix，dehydration and verification，paraffin and embedding，staining，section，sticking and so on.These methods effectively improve the efficiency of making slides and provide references for staff to do scientific research and teach by making use of the paraffin section technology.

fennel;mature petioles;paraffin section

G945.79

A

1007-5348（2014）12-0041-05

（责任编辑：邵晓军）

2014-05-18

国家自然科学基金项目（31070287）；国家级大学生创新创业训练计划建设项目（201310576-003）.

陈土娟（1989-），女，广东湛江人，韶关学院英东农业科学与工程学院学生，主要从事芳香植物栽培与生理方面的研究.*通讯作者.