一株纤维素酶产生菌SWU6菌株的筛选鉴定＊

吴晶晶 王爱印 周 敏 陈 林 谢 洁

（西南大学生物技术学院，重庆 400715）

蚕桑产业副产物蚕沙及桑枝富含纤维素，但均未被有效利用［1－3］。我国仅五大蚕区的蚕沙年产量已超过100万t［4］；2013年我国桑园面积超过84．7万hm2［5］，桑树用叶后产生大量废弃桑枝。目前，大部分蚕沙被直接废弃或不经处理作为农田肥料［1］，而桑枝常被废弃田间或焚烧［3，6］。蚕沙及桑枝现有处理方式，不仅带来极大的环境污染，也使蕴藏在其中以纤维素为主的生物质能源未被有效利用。多种真菌、细菌能通过产生纤维素酶而在自然界纤维素的降解过程发挥作用［7－8］。富含纤维素生物质原料的酶解条件温和，且不带来次生环境污染，筛选获得纤维素酶高产菌株对蚕桑产业副产物的有效利用具有重要作用。

校园富含枯枝落叶的土壤有利于纤维素酶产生菌的富集。在长期适应环境的过程中，土壤中存在的微生物可以通过分泌包括纤维素酶在内的多种酶类参与环境物质循环。本研究选择从校园绿化林地土壤中分离纤维素酶产生菌，通过刚果红培养基水解圈法及胞外纤维素酶测定方法筛选纤维素酶高产菌株，并对产酶菌株进行了菌种鉴定。以期为包括蚕沙、桑枝在内的富含纤维素生物质原料的降解及洁净能源的开发提供潜在生产菌。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 土壤样品

采自西南大学校园绿化地。

1．1．2 培养基配方

初筛培养基（羧甲基纤维素钠培养基）：CMC－Na 15g，NH4NO31g，蛋白胨1g，MgSO4·7H2O 0．5g，KH2PO41g，琼脂20g，H2O 1 000mL，pH7．0，121℃灭菌20min后备用［9］。鉴别培养基（刚果红培养基）：KH2PO40．5g，MgSO40．25g，琼脂18．0g，明胶2．0g，CMC－Na 2．0g，刚果红0．20g，蒸馏水1 000mL，pH7．0［9］。液体发酵培养基：蛋白胨10g，酵母粉10g，CMC－Na 10g，NaCl 1．5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0．3g，pH7．0［10］，蒸馏水1 000mL。

1．2 方法

1．2．1 纤维素酶产生菌的分离

称取1g土壤样品加入到99mL含有玻璃珠的生理盐水中，作为10－2稀释度，振荡30min混匀后做一系列10倍稀释，将10－3、10－4、10－5稀释液各取100μL涂布于初筛羧甲基纤维素钠培养基，每个稀释度2次重复。28℃培养48h挑取生长较快的单菌落在羧甲基纤维素钠培养基上纯化获得纯培养［11］。

1．2．2 纤维素酶产生菌的筛选与保存

初筛获得的菌株用灭菌接种环点接至刚果红培养基表面，每个菌株3个重复，28℃培养48h，根据菌体在刚果红培养基平板上形成水解圈直径（D）与菌落直径（d）比值的大小，初步判断菌株纤维素酶活性，之后选取直径比（D／d）较大且生长迅速的菌株进行下一步研究［12］。同时，从平板上挑取单菌落接种至液体发酵培养基，160r／min震荡培养24h后，取500uL菌液加入等体积30%甘油，于1．5mL离心管中混匀后保存至－80℃冰箱备用。

1．2．3 葡萄糖标准曲线绘制

精确称取100℃干燥至恒重的葡萄糖0．10g，加蒸馏水溶解并定容至1．00ml，配成1．00mg／ml的葡萄糖标准溶液。取7支带有刻度的试管，首先按表1加入葡萄糖标准溶液，并用蒸馏水定容至总体积2mL后加入DNS试剂3mL，沸水浴反应10min，取出冷却后补加蒸馏水至总体积25ml，充分混匀，用空白管溶液调零，在540nm测定各管的吸光值。用EXCEL软件，以葡萄糖质量数（mg）为纵坐标，吸光值为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

表1 绘制葡萄糖标准曲线时加入各试管中的葡萄糖量

1．2．4 纤维素酶活性的测定

参照葡萄糖标准曲线，用DNS法测定产酶菌株发酵上清液水解CMC－Na后生成的葡萄糖量。酶促反应体系包括用0．2MpH4．8的乙酸缓冲液配置的1%CMC－Na溶液1mL，目的菌株发酵上清液1mL（对照管加入灭活的发酵上清液），充分混匀后置于50℃酶促反应30min，随后迅速加入DNS试剂3mL，沸水浴10min后加入去离子水定容至25mL。用对照管调零，在540nm测定吸光值，根据葡萄糖标准曲线，以三次平行测定平均值计算还原糖生成量［13］。以每毫升发酵上清液酶促反应30min释放1ug葡萄糖的量为一个酶活单位（U）。本研究测定了目的菌株发酵12h，24h，48h，72h及96h菌株SWU6发酵上清液的纤维素酶活性。

1．2．5 菌种鉴定

1．2．5．1 菌体培养特征、形态观察

在28℃，马铃薯葡萄糖固体培养基上培养目的菌株24～48h观察菌落形态特征，将目的菌株接种到刚果红培养基上培养48h后观察菌落水解圈。将在马铃薯固体培养基上培养24～48h的目的菌株进行革兰氏染色和芽孢染色。

1．2．5．2 生理生化反应特征测定

菌株需氧性、运动性测定、过氧化氢酶试验、淀粉水解、明胶液化试验、硝酸盐还原等试验均参照文献进行［14，15］。

1．2．5．3 基于16SrDNA序列的系统发育分析

将目的菌株接种至PDA固体培养基37℃培养36h后，提取基因组DNA作为模板，用细菌16SrDNA基因通用引物进行PCR扩增。引物序列为27F：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′和1492R：5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′。PCR反应条件为：95℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸8min，扩增产物进行1．0%琼脂糖凝胶电泳检测后，纯化PCR产物送至上海生物工程股份有限公司测序。所得16SrDNA序列在 GenBank里进行比对（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST），下载同源性较高序列，利用MEGA4．0软件，使用N－J法进行1 000次步长计算，构建系统发育树［16］。

2 结果与分析

2．1 纤维素酶产生菌的分离与筛选

从校园绿化地土壤中初筛获得10个能够产生纤维素酶的分离株，将其接种于鉴别培养基，28℃培养48h后测量水解圈直径与菌落直径的比值，其中SWU6菌株水解圈与菌落直径比值最大，为9．12（表2）。

表2 纤维素酶产生菌水解圈直径与菌落直径比值

图1 SWU6菌株发酵不同时间发酵上清液纤维素酶活力

2．2 纤维素酶活性的测定

根据葡萄糖标准曲线计算回归方程为：y＝0．646 8x＋0．044 4，R2＝0．986 8，并据此测定目的菌株SWU6发酵12h，24h，48h，72h及96h上清液的纤维素酶活性分 别 为 110．37U／mL，136．24U／mL，131．93U／mL，126．55U／mL，126．98U／mL（图1）。SWU6菌株发酵前期纤维素酶活性逐渐升高，24h左右达到峰值，随后单位体积发酵上清液的纤维素酶活性呈下降趋势。

2．3 菌种鉴定

2．3．1 菌落及菌体形态特征

图2 SWU6菌株在PDA培养基上的菌落特征

SWU6菌株在PDA培养基表面形成的菌落呈乳白色、透明、湿润、圆形，表面光滑，中央凸起，有光泽（图2）。其在半固体培养基表层扩散生长，为具运动性的好氧菌（表3）。革兰氏染色结果表明SWU6菌株为革兰氏阳性杆状细菌（图3，表3）。SWU6菌株经芽孢染色后观察，其菌体中央具有单个椭圆形绿色芽孢（图4，表3）。

表3 菌株SWU6的形态及培养特征

图3 SWU6菌株革兰氏染色结果

图4 SWU6菌株芽孢染色结果

2．3．2 SWU6菌株的生理生化特征

生理生化检测结果表明，纤维素酶产生菌SWU6菌株过氧化氢酶、硝酸盐还原呈阳性；能够水解淀粉、液化明胶；能够在含7%NaCl的培养基中生长（表4）。结合对菌株SWU6的形态及培养特征菌株观察结果，初步判断纤维素酶产生菌SWU6为芽孢杆菌属菌株。

表4 菌株SWU6的生理生化特征

2．3．3 基于16SrDNA的系统发育分析

以SWU 6菌株基因组DNA为模板，用16SrDNA通用引物进行PCR扩增，得到一条长约1500bp的片段。回收目的片段送至上海生物工程股份有限公司测序，得到一条长为1457bp的片段。该序列在NCBI上的Blast序列比对结果显示，其与多株芽孢杆菌属菌株的16SrDNA序列的相似度在98%以上，基于16SrDNA的系统发育分析结果表明SWU6菌株与登录号为NR 116240甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus）处于同一最小分支 （图5）。根据SWU6菌体形态、培养特征及生理生化特征测定结果，并结合基于16S rDNA的系统发育分析，将该纤维素酶产生菌鉴定为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus）。

图5 SWU6菌株基于16SrDNA的系统发育树

3 讨 论

利用纤维素酶高产菌株对蚕沙、桑枝等富含纤维素的生物质原料进行处理能为开发洁净能源提供新的选择。本文利用鉴别培养基水解圈法筛选获得纤维素酶产生菌SWU6菌株，并采用胞外酶活检测方法（DNS法）测定了发酵不同时间上清液的纤维素酶活性。检测结果表明SWU6菌株发酵24h，其纤维素酶活达到峰值。根据该菌株的形态特征、生理生化检测结果以及基于16SrDNA的系统发育分析，将其鉴定为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus）。芽孢杆菌是自然界中降解纤维素的主要细菌，其中枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌常表现出最高的纤维素酶生产活性［17］，而甲基营养型芽孢杆菌产生纤维素酶却鲜见报道。

蚕沙、桑枝等蚕桑产业副产物的加工处理通常需要纤维素酶、木质素降解酶类及半纤维素酶等多种酶协同完成。后续研究将在本文研究基础上，优化B．methylotrophicusSWU 6菌株产纤维素酶发酵条件。同时，进一步分离筛选多种酶类的高产菌株，构建复合菌剂，用其处理蚕沙、桑枝等废弃生物质原料，以期在生产中提高蚕桑产业副产物加工处理的效率及质量。

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