急性冠脉综合征患者外周血CD4＋CD25＋CD127low调节性T细胞的变化及意义

2014-02-13徐林杰吴继雄许邦龙王晓晨彭晓云何非

安徽医科大学学报 2014年5期

徐林杰，吴继雄，许邦龙，王晓晨，彭晓云，何非

徐林杰，吴继雄，许邦龙，王晓晨，彭晓云，何非

目的探讨急性冠脉综合征（ACS）患者外周血CD4＋CD25＋CD127low调节性T细胞（Treg）的变化及意义。方法收集行冠状动脉造影检查的住院患者96例，按照1979年WHO冠心病诊断和分型标准，将患者分为3组：ACS 组48例、稳定性心绞痛（SAP）组24例、正常对照组24例。采用流式细胞术检测各组患者外周血CD4＋CD25＋CD127lowTreg细胞水平，同时检测并比较各组患者超敏C反应蛋白（hs-CRP）、外周血白细胞（PWBC）计数水平。结果ACS组外周血CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋细胞比例［（3.18± 1.76）%］显著低于正常对照组［（5.64±1.63）%］和SAP组［（5.60±1.56）%］（F＝25.247，P＜0.01），而ACS组外周血hs-CRP、PWBC计数水平明显高于正常对照组和SAP组（P＜0.05）。此外，患者外周血CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋细胞比例的下降与hs-CRP和PWBC计数的升高呈负相关（r分别为－0.518、－0.311，P＜0.01）。结论ACS患者外周血中Treg细胞比例的下降可能通过破坏外周免疫耐受平衡和激活炎症反应参与动脉粥样硬化的发生发展过程。

急性冠脉综合征；调节性T细胞；超敏C反应蛋白；白细胞；流式细胞术

随着人们生活水平的不断提高，心血管疾病的发病率和死亡率逐年上升。急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）发病急、病情危重、死亡率高，是临床常见的心血管急重症，包括不稳定型心绞痛（unstable angina，UA）和急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）［1］。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是其主要的病理性基础，目前认为AS是一种慢性炎症性疾病，免疫细胞尤其是CD4＋T细胞在其中发挥重要作用。调节性T细胞（regulatory T cells，Treg细胞）是一组特殊的具有免疫负调节功能的CD4＋T细胞亚群，在AS和ACS发生、发展的各个阶段均发挥着重要的作用。近年来相关研究［2］表明ACS患者外周血CD4＋CD25＋Treg细胞数量减少。CD127作为Treg细胞新的表面标志物，在ACS中的研究较少，因此通过标记CD127，采用流式细胞仪检测ACS组、稳定性心绞痛（stable angina pectoris，SAP）组和正常对照组外周血CD4＋CD25＋CD127lowTreg细胞水平的变化，及其与超敏C反应蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）、外周血白细胞（peripheral white blood cell，PWBC）计数之间的关系，探讨免疫调节因素在ACS中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象收集2012年8月～2013年6月在安徽医科大学第二附属医院心血管内科行冠状动脉造影等检查的住院患者96例，按照1979年WHO冠心病诊断和分型标准，其中ACS组48例，包括AMI 18例和UA 30例；SAP组24例；经临床症状、心电图、经胸心脏彩色多普勒超声、冠状动脉造影检查排除其他器质性心脏疾病的正常对照组24例。所有患者均排除肿瘤、感染、自身免疫性疾病、严重肝肾疾病、血液系统疾病及近期服用免疫抑制剂。

1.2 试剂与仪器藻红蛋白（PE）标记的抗人CD127单抗（克隆号hiL-7R-M21）、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的小鼠抗人CD25单抗（克隆号U7.27）和PE-Cy5-CD4同型阴性对照试剂购自美国Beckman-Coulter公司；溶血剂为0.83%的氯化铵溶液，由安徽医科大学第二附属医院血液病实验室用去离子蒸馏水自行配制。流式细胞仪为美国Beckman-Coulter公司FC500系列，荧光激发光波长为488 nm 和633 nm，分析软件为CXP系统。

1.3 实验方法

1.3.1 血清生化检测所有患者常规检测血常规、肝肾功能、血糖、血脂，同时采用免疫散射比浊法测定hs-CRP。

1.3.2 流式细胞仪检测Treg细胞的百分率患者均于夜间禁食12 h后清晨空腹平卧位、严格无菌操作采集肘静脉血2 ml，肝素抗凝，4 h内送检血液病学实验室行流式细胞仪检测。检测时首先根据前向（FSC）和侧向（SSC）散射光信号对淋巴细胞群进行设门，每份标本获取设门内细胞在10 000个以上。将收集的全血1 500 r／min离心5 min，弃上清液，留取沉淀细胞并打散，加入PBS，再反复离心洗涤3次，制成细胞悬液，调整细胞数为（1～6）×106／ml。采用三色直接免疫荧光标记法：首先取2支试管分别加入抗凝全血100 μl，其中一管加入CD25-FITC、CD127-PE以及CD4-PC5-Cy5单抗各10 μl，另一管则作为对照管加入CD4-PC5-Cy5、FITC-IgG1和各单抗相对应的同型对照PE 10 μl，充分混匀后室温下避光孵育15 min，加入1 ml溶血剂，37℃水浴箱内放置10 min左右，待完全溶血后立刻上流式细胞仪检测，检测后数据以Listmode文件形式保存。

1.4 统计学处理采用SPSS 17.0统计软件进行分析，数据以±s表示，符合正态分布和方差齐性检验的计量资料多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），进一步两两比较采用LSD检验，计数资料间比较采用χ2检验，部分指标采用Pearson直线相关分析。

2 结果

2.1 各组一般临床资料的比较各组年龄、性别、吸烟、高血压、空腹血糖（Glu）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL-c）等冠心病危险因素的比较差异无统计学意义（P＞0.05）。ACS组和SAP组高密度脂蛋白（HDL）水平明显低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），而ACS组和SAP组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 各组外周血Treg细胞检测的比较ACS组外周血CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋细胞比例明显低

图1 各组Treg细胞的流式检测图

表1 各组一般情况（±s）

与正常对照组比较：※※P＜0.01

项目正常对照组（n＝24）SAP组（n＝24）ACS组（n＝48）F／χ2值P值男／女（例）15／915／934／140.7500.687高血压（例）915304.5710.102糖尿病（例）915300.6430.725吸烟（例）815185.2360.073年龄（岁）58.63±10.3456.88±9.0961.77±10.192.1370.124 Glu（mmol／L）5.50±0.665.73±0.525.60±1.180.3500.706 TC（mmol／L）3.86±0.843.99±1.213.62±1.061.1190.331 TG（mmol／L）1.14±0.451.09±0.520.91±0.601.6910.190 LDL-c（mmol／L）2.43±0.592.32±1.052.41±0.870.1440.866 HDL（mmol／L）1.30±0.320.84±0.41※※0.91±0.35※※11.8940.000

于正常对照组和SAP组，差异有统计学意义（P＜0.01），SAP组外周血CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋细胞比例与正常对照组比较差异无统计学意义（P ＞0.05），见表2、图1。ACS组外周血Treg细胞／CD4＋CD25＋CD127high比值低于正常对照组（P＜0.01），而SAP组和正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各组外周血流式细胞仪检测结果（±s）

与正常对照组比较：※※P＜0.01；与SAP组比较：＃＃P＜0.01

项目正常对照组（n＝24）SAP组（n＝24）ACS组（n＝48）F值P值CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋细胞比例（%）25.247 0.000 CD4＋CD25＋CD127high占CD4＋细胞比例（%）5.64±1.635.60±1.56 3.18±1.76※※＃＃5.41±2.015.40±2.24 5.69±1.810.243 0.785 Treg细胞／CD4＋CD25＋CD127high1.30±0.601.07±0.41 0.94±0.34※※5.644 0.005

2.3 各组外周血hs-CRP、PWBC计数比较统计结果显示：ACS组hs-CRP、PWBC计数均明显高于正常对照组和SAP组，差异有统计学意义（P＜0.05），SAP组中PWBC计数与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），hs-CRP水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 各组外周血hs-CRP、PWBC计数的比较（±s）

与正常对照组比较：※※P＜0.01；与SAP组比较：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

项目正常对照组（n＝24）SAP组（n＝24）ACS组（n＝48）F值P值hs-CRP（mg／L）2.82±2.863.14±3.047.36±1.77※※＃＃39.140 0.000 PWBC（×109／L）5.54±1.126.86±0.77※※7.65±1.63※※＃19.696 0.000

2.4 CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋细胞比例与hs-CRP、PWBC计数的相关性对上述3项指标采用Pearson直线相关分析，结果显示CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋细胞比例和hs-CRP、PWBC计数呈负相关（P＜0.01），见表4。hs-CRP和PWBC计数具有正相关性（r＝0.296，P＝0.03）。

表4 CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋细胞比例与hs-CRP、PWBC计数的相关性分析

3 讨论

ACS是由于冠状动脉内不稳定的斑块破溃和斑块内出血，继发血栓形成，导致冠状动脉管腔堵塞的一组临床综合征，其病程包括炎性反应和自身免疫反应［3］。Treg细胞是一组具有免疫负调节功能的T细胞亚群，CD4＋CD25＋Treg细胞为其中数量少而作用重要的一群T淋巴细胞，具有免疫抑制性和免疫无能性，通过细胞间接触和分泌具有抑制作用的细胞因子来发挥免疫负调节作用，维持机体内环境的稳定［4］。CD127是IL-7受体α链，在T淋巴细胞的增殖、分化和成熟中起重要作用，CD127在Treg细胞中低表达，联合应用CD25高表达和CD127低表达，能够有效去除CD25＋T淋巴细胞中效应T淋巴细胞，从而准确反映Treg细胞的数量［5］。

研究［6－7］显示通过输注或诱导产生Treg细胞可延缓AS的发展、抑制动脉粥样硬化斑块的形成，表明Treg细胞在AS及ACS的调节中起着重要的作用。Sardella et al［8］研究发现ACS患者的CD4＋CD25＋Treg细胞数量减少，并且其抑制CD4＋CD25－效应T淋巴细胞增殖的能力减弱。本研究通过流式细胞仪检测ACS组、SAP组及正常对照组外周血CD4＋CD25＋CD127lowTreg细胞表达水平，结果显示ACS组外周血CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋细胞比例显著低于SAP组和正常对照组，推测可能由于CD4＋CD25＋CD127lowTreg细胞的数量减少减弱了对机体炎症反应的抑制作用，机体更易于发生炎症免疫应答，从而导致炎症激活、斑块不稳定及ACS的发生。因此，对CD4＋CD25＋CD127lowTreg细胞的检测有可能作为衡量动脉粥样硬化斑块是否稳定的指标之一。此外，SAP组的Treg细胞表达与正常对照组比较差异无统计学意义，可能由于SAP患者体内多是稳定性斑块，并且局部炎症反应较轻。

CD4＋效应性T细胞活化后高表达CD127 （CD127high），而真正的Treg细胞低表达CD127 （CD127low），因此CD127high可作为机体活化效应性T细胞的表面标志物［9］。王剑等［10］研究发现CD4＋CD25＋CD127lowTreg细胞具有抑制效应性T淋巴细胞增殖的能力，而且随着CD4＋CD25＋CD127lowTreg细胞的减少，CD4＋CD25＋CD127highT淋巴细胞的增殖指数逐步升高。基于Treg细胞与效应性T淋巴细胞的相互抑制作用，控制Treg细胞／CD4＋CD25＋CD127high的比值、提高效应性T淋巴细胞对Treg细胞的抑制作用可能为ACS患者提供一种新的免疫治疗方案［11］。

CRP是人体非特异性炎症反应最敏感的标志物之一，目前hs-CRP在AS发生发展过程中的作用日益明显，hs-CRP可以作为炎性指标中预测冠心病事件的独立因子［12］。本研究结果显示，正常对照组、SAP组及ACS组hs-CRP水平呈上升趋势，其中在ACS组升高显著，表明体内可能存在内环境紊乱、炎性反应增加、免疫活动过强等情况。

Hillis et al［13］研究发现PWBC计数水平在冠心病患者中明显升高，而且病变严重时和急性期更加明显，同时发生PWBC计数水平与ACS患者住院不良事件的发生呈显著正相关。本研究结果显示，ACS组的PWBC水平较SAP组和正常对照组显著升高，SAP组PWBC水平较正常对照组也明显升高。同时CD4＋CD25＋CD127low占CD4＋细胞比例与hs-CRP、PWBC计数的相关性分析显示其存在负性相关，表明冠心病患者体内炎性反应高度激活，免疫活动过强与体内CD4＋CD25＋CD127lowTreg细胞降低存在一定联系，但其具体机制尚不明确，需要进一步研究。

综上所述，CD4＋CD25＋CD127lowTreg细胞在AS 和ACS的发生、发展中扮演了很重要的角色，但由于本研究的样本量较小，实验结果存在一定的局限性。今后通过更大样本、更完善的临床试验深入研究Treg细胞在AS及ACS中的免疫调节机制，有助于寻找免疫治疗新策略。

［1］Singh S K，Suresh M V，Voleti B，et al.The connection between C-reactive protein and atherosclerosis［J］.Ann Med，2008，40（2）：110－20.

［2］凌佳，朱彦琪，金炜.急性冠脉综合征患者血清调节性T细胞的变化及其临床意义［J］.中国心血管杂志，2008，4（13）：258－61.

［3］Hansson G K，Hermansson A.The immune system in atherosclerosis［J］.Nat Immunol，2011，12（3）：204－12.

［4］Shigematsu Y，Hanagiri T，Shiota H，et al.Immunosuppressive effect of regulatory T lymphocytes in lung cancer，with special reference to their effects on the induction of autologous tumor-specific cytotoxic T lymphocytes［J］.Oncol Lett，2012，4（4）：625－30.

［5］王会平，翟志敏，张爱梅，等.CD4＋CD25＋CD127low识别人外周血CD4＋CD25＋调节性T细胞的优势［J］.分子与细胞免疫学，2008，24（12）：1059－62.

［6］Li H，Ding Y，Yi G，et al.Establishment of nasal tolerance to heat shock protein-60 alleviates atherosclerosis by inducing TGF-β-dependent regulatory T cells［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2012，32（1）：24－30.

［7］Zhong Y，Wang X，Ji Q，et al.CD4＋LAP＋and CD4＋CD25＋Foxp3＋regulatory T cells induced by nasal oxidized low-density lipoprotein suppress effector T cells response and attenuate atherosclerosis in ApoE－／－mice［J］.J Clin Immunol，2012，32（5）：1104－17.

［8］Sardella G，De Luca L，Francavilla V，et al.Frequency of naturally-occurring regulatory T cells is reduced in patients with ST-segment elevation myocardial infarction［J］.Thromb Res，2007，120 （4）：631－4.

［9］钱晓君，赵磊，陆友金，等.CD4＋CD25＋CD27low调节性T细胞在结核性及恶性胸腔积液患者中的表达及意义［J］.安徽医科大学学报，2013，48（3）：279－82.

［11］于益芝，曹雪涛.调节性T细胞在肿瘤免疫和肿瘤免疫治疗中的作用［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2010，17（1）：1－6.

［12］Anand S S，Yusuf S.C-reactive protein is a bystander of cardiovascular disease［J］.Eur Heart J，2010，31（17）：2092－6.

［13］Hillis G S，Dalsey W C，Terregino C，et al.Altered CD18 leukocyte integrin expression and adhesive function in patients with an acute coronary syndrome［J］.Heart，2001，85（6）：702－4.

The change and clinical significance of circulating CD4＋CD25＋CD127lowregulatory T cells in patients with acute coronary syndrome

Xu Linjie，Wu Jixiong，Xu Banglong，et al
（Dept of Cardiology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

ObjectiveTo investigate the change of CD4＋CD25＋CD127lowregulatory T（Treg）cells in peripheral blood of patients with acute coronary syndrome（ACS）and explore its clinical significance.Methods96 subjects were divided into three groups：ACS（n＝48），stable angina pectoris（SAP，n＝24）and normal patients（n＝24）.CD4＋CD25＋CD127lowTreg cells were detected by flow cytometry，and the levels of high-sensitivitiy C-reactive protein（hs-CRP），peripheral white blood cells（PWBC）were tested in each group.ResultsThe ratio of CD4＋CD25＋CD127lowTreg cells in peripheral blood of patients with ACS［（3.18±1.76）%］was significantly lower than that of normal patients［（5.64±1.63）%］and patients with SAP［（5.60±1.56）%］（F＝25.247，P＜0.01）.The levels of hs-CRP，PWBC in patients with ACS were higher than that of normal patients and patients with SAP（P＜0.05）.Besides，the level of CD4＋CD25＋CD127lowTreg cells was negatively correlated with hs-CRP and PWBC（r＝－0.518，－0.311 respectively；P＜0.01）.ConclusionIn ACS patients，the decreased Treg cells may participate in the development of atherosclerosis through break the balance of peripheral immune-tolerance and activate the inflammatory response.

acute coronary syndrome；regulatory T cells；high-sensitivitiy C-reactive protein；white blood cell；flow cytometry

R 541.4；R 392.12；R 341

1000－1492（2014）05－0637－04

2013－11－25接收

安徽医科大学第二附属医院心血管内科，合肥 230601

徐林杰，女，硕士研究生；

吴继雄，男，副教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：WJX8261＠163.com