卡波肉瘤相关疱疹病毒ORFK12蛋白初步研究

汪小五，曾宪聪，陈 伟，张 莹，吴 悦，杜爱能，刘璐璐，王林定

卡波肉瘤相关疱疹病毒ORFK12蛋白初步研究

汪小五，曾宪聪，陈 伟，张 莹，吴 悦，杜爱能，刘璐璐，王林定

目的研究卡波肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）ORFK12基因在大肠杆菌的表达及表达的蛋白在普通人群中检测KSHV的感染情况。方法设计一对特异性引物，以BCBL-1细胞总DNA为模板，采用PCR方法扩增KSHV ORFK12基因。构建含目的基因的重组质粒命名为PQE-80L-K12和诱导蛋白表达。采用ELISA法和Western blot法筛查临床收集的血清标本中感染KSHV的情况。结果异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导后的PQE-80L-K12重组菌经十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示有一个约10 ku的融合表达蛋白为ORFK12蛋白。采用ELISA法和Western blot法检测显示ORFK12蛋白能与KSHV阳性血清反应。结论KSHV ORFK12基因在大肠杆菌中表达，表达的ORFK12蛋白在实验室检测感染KSHV有一定的辅助作用。

卡波肉瘤相关疱疹病毒；ORFK12基因；ORFK12蛋白

卡波肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）是由美国哥伦比亚大学华裔病理学家Chang等于1994年对卡波肉瘤（Kaposi′s sarcoma，KS）组织中特异DNA进行检测时发现的，是双链DNA病毒［1－2］。经研究［3］显示KSHV是KS、原发渗液性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）、多中心卡斯特慢病（multicentric Castleman disease，MCD）的病原体。K12基因编码的蛋白被称为卡波济蛋白，它是KSHV感染潜伏期所特有的蛋白［4］，几乎在所有的KS纺锤样细胞和潜伏感染的原发渗液性淋巴瘤细胞中表达［5］。笔者通过对KSHV K12基因进行基因扩增，诱导其表达，表达蛋白检测与血清的反应情况，为研究KSHV的致病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源细胞系BCBL-1、表达载体PQE-80L质粒、宿主大肠杆菌DH5a、BL21（DE3）为本实验室保存；pEASY-T1 simple cloning kit购自北京全式金生物技术有限公司；Ni-NTA购自美国GE公司。

1.2 工具酶和试剂BamHⅠ、SalⅠ购自美国Fermentas公司；质粒小抽提取试剂盒购自美国Axygen有限公司；PVDF膜购自美国Bio-Rad公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗人IgG抗体、碱性磷酸酶（ALP）标记的山羊抗人IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 重组T质粒的构建和重组质粒PQE80-L-K12的构建及表达与纯化

1.3.1 PCR引物的设计与合成 参照NCBI上的K12序列设计引物如下，上游引物：5′-TTGGATCCATGGATAGAGGCTTAACG-3′；下游引物：5′-TTGTCGACTTAGTGCGCGCCCGTTGC-3′（下划线部分分别为BamHⅠ、SalⅠ的酶切位点），以BCBL-1细胞总DNA为模板，按照设计好的K12序列的上、下游引物送至上海生工生物公司合成。PCR反应条件：95℃变性5 min，然后94℃1 min，50℃30 s，72℃1 min热循环35次，最后72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，大小正确，用胶回收试剂盒切胶回收PCR产物。

1.3.2 重组T质粒的构建 切胶回收的PCR产物PCR-K12与pEASY-T1载体用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，铺板于氨苄（Amp）抗性的LB培养基平板上（铺板前在LB培养基平板上均匀涂布8 μl的500 mmol／L IPTG和40 μl的20 mg／ml半乳糖苷酶（X-gal）混合液，用于蓝白斑筛选），置于37℃恒温培养箱倒置培养过夜。次日挑取白斑单菌落转接于3 ml含Amp的LB培养基上37℃恒温摇床200 r／min培养过夜后提取质粒，用BamHⅠ、SalⅠ做双酶切鉴定。酶切正确的重组T质粒做基因测序进一步鉴定。

1.3.3 重组质粒PQE-80L-K12的构建 PQE-80L表达载体和测序正确重组T质粒用BamHⅠ、SalⅠ同时做双酶切，回收双酶切后的PQE-80L的载体和目的基因ORFK12用T4连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌BL21感受态细胞，其后的构建过程如构建重组T质粒过程一样，同样提取质粒做双酶切和测序鉴定。

1.3.4 目的蛋白诱导表达及表达蛋白纯化 经鉴定的重组PQE-80L-K12转化菌接种于3 ml含有Amp青霉素的LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床200 r／min培养过夜后。将过夜培养物取60 μl转入3 ml含Amp青霉素的LB液体培养基中（转种比例1∶50），培养3 h后，取出1 ml培养物作为诱导前样品后，按1∶1 000比例加入IPTG诱导剂，其终浓度为1 mmol／L。37℃、200 r／min摇床继续培养8 h，再取1 ml培养物作为诱导后的样品。诱导前样本和诱导后样本SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况，确认蛋白已表达后，次日扩大培养（500 ml LB培养液）。

表达蛋白制备：收集扩大培养的表达菌体（500 ml LB培养液），在4℃、7 000 r／min离心15 min，弃上清液，用100 ml裂解缓冲液（非变性）裂解沉淀，蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为1 mmol／ml，加入溶菌酶至终浓度1 mg／ml。冰上放置40 min。用超声波细胞破碎仪破碎细胞，功率300 W，超声3 s间隔10 s，破碎3次。于4℃以8 000 r／min离心15 min之后，用灭菌的移液枪将上清液移至50 ml的离心管里，再用0.45 μm的滤膜过滤即为上清粗蛋白，留下的沉淀加50 ml变性的裂解缓冲液室温溶解，8 000 r／min离心15 min后取上清液并且用0.45 μm的滤膜过滤后即为包涵体粗蛋白。10 μl的上清粗蛋白和10 μl的包涵体粗蛋白样品经SDSPAGE电泳确定目的蛋白的表达位置。

用10倍柱体积的超纯水清洗柱子，将已预处理好的Ni-NTA悬浮液混匀填装柱子，体积约1.5 ml。将包涵体蛋白样品或者上清蛋白样品经过Ni-NTA柱进行纯化。依次用5倍柱体积的裂解缓冲液，5倍柱体积的洗脱缓冲液过柱，洗脱杂蛋白。最后用5倍柱体积的洗脱液缓冲液洗脱吸附在Ni柱中的目的蛋白，分管收集样品。纯化的蛋白经SDSPAGE电泳鉴定。

1.4 ELISA法筛查临床血清标本包被：上述纯化的含目的蛋白样品用pH 9.6的包被缓冲液稀释到1 ng／μl，将其作为抗原，在96孔酶标板中加入50 μl，4℃包被过夜；洗板：PBS-T洗板5次；封闭：每孔加入250 μl含5%脱脂奶粉和1%山羊血清的PBS溶液，37℃孵育1 h；洗板：PBS-T洗板5次；第一抗体结合：利用本实验室制备的KSVH ORF65、ORF73 和ORFK8.1蛋白作为抗原从蚌埠地区普通人群血清中筛选的KSHV阳性，阴性血清（包括32份阳性和32份阴性）作为一抗，其血清按1∶100比例稀释，每孔加入50 μl，37℃孵育1 h；洗板：PBS-T洗板5次；第二抗体结合：采用AP标记的山羊抗人的抗体作为二抗，按1∶2 000比例每孔加入50 μl，37℃孵育1 h；洗板：PBS-T洗板5次；显色：以p-NPP作为显色剂，用显色缓冲液稀释到1 mg／ml后每孔加入50 μl，37℃孵育15 min，加入3 mol／L NaOH溶液终止反应，用酶标仪测405 nm处的吸光度（optical density，OD）值。每份样本重复3次。分析纯化的目的蛋白与血清里的相应抗体的反应情况。结果判定：以阴性样品OD值平均值加上5倍标准差（standard deviation，STD）为Cut-Off值。样品OD值高于Cut-Off值则认为该血清与ORFK12基因表达的蛋白有反应。有反应的阳性血清和无反应的阴性血清用于Western blot实验进一步确认其与血清的反应情况。

1.5 Western blot法鉴定ORFK12蛋白与血清的反应性纯化了的目的蛋白经SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜上，PVDF膜放在封闭液中封闭2 h，与1∶100稀释的从以上利用ELISA法筛选出的10份有反应的阳性血清和无反应的阴性血清随机各取3份作为一抗4℃孵育过夜。再与HRP标记的山羊抗人IgG抗体（1∶20 000）室温孵育1 h，将化学发光底物试剂加至PVDF膜上。把X线片覆盖在膜上压紧曝光，拍照观察结果。

2 结果

2.1 KSHV ORFK12基因PCR扩增PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上出现了约183 bp大小的条带，与预期的183 bp扩增片段大小一致。见图1A。

2.2 重组T质粒酶切和测序鉴定重组转化菌经LB液体培养基过夜培养后提取质粒。质粒用BamHⅠ、SalⅠ做双酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳，在琼脂糖凝胶上出现两条特异性条带，其中一条约为5 100 bp，还有一条约为183 bp，证明KSHV ORFK12基因已经与T载体连接成功。酶切有目的条带的重组T质粒拿到公司进行测序，测序结果正确。见图1B。

2.3 重组PQE-80L-K12质粒酶切和测序鉴定提取重组质粒，同样用BamHⅠ、SalⅠ做双酶切后经琼脂糖凝胶电泳验证，结果出现其中一条约为5 000 bp，还有一条约为183 bp，证明KSHV ORFK12基因已经PQE-80L表达载体连接成功。酶切有目的条带的重组质粒拿到公司进行测序，测序结果正确。见图1C。

图1 ORFK12目的基因PCR扩增和重组质粒双酶切鉴定

2.4 转化、诱导及纯化含目的基因KSHV ORFK12基因的表达质粒转化到BL21受体菌中，经终浓度1 mmol／L IPTG诱导后，SDS-PAGE电泳鉴定，重组蛋白以包涵体形式表达。包涵体经0.45 μm的滤膜滤过后的包涵体粗蛋白经过Ni亲和层析填料纯化后得到了约10 ku的蛋白，箭头处指的是表达的目的蛋白ORFK12蛋白。见图2。

图2 KSHV ORFK12蛋白的表达与纯化

2.5 ELISA法筛查临床血清情况以纯化的蛋白作为抗原，采用ELISA法检测64份血清样本中KSHV感染情况的检测，结果发现32份阳性血清中有10份检测后OD值高于临界值（Cut-Off值为0.705），32份阴性血清经检测后OD值低于Cut-Off值。

2.6 Western blot鉴定ORFK12蛋白与血清的反应性纯化的目的蛋白经SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜上，进行Western blot鉴定，纯化的蛋白与KSHV阳性血清有反应印迹，与KSHV阴性血清没有反应印迹，初步证明KSHV ORFK12基因表达蛋白与血清中相应抗体有反应性。见图3。

图3 Western blot检测ORFK12蛋白与KSHV＋和KSHV-血清

3 讨论

KSHV又称人类疱疹病毒8型病毒，属于γ疱疹病毒亚科，是双链DNA病毒［6］。KSHV在部分非洲和欧洲尤其是意大利和南部地中海国家比较常见。目前我国对KSHV的研究才开始不久，有研究［7］表明新疆地区经典型KS的发病率较高，而其他地区和民族的KS病例则比较罕见。KS是一种在感染AIDS患者中常见的肿瘤，致病机制很复杂［4］。KSHV的研究已经有不少报道如ORFK8.1基因、ORFK73基因［1，8-10］。针对于KSHV编码的蛋白可以分为潜伏感染相关蛋白和裂解感染相关蛋白［11］。

笔者通过PCR技术、ELISA法和Wersten blot法［1］构建含有目的基因的T载体和PQE-80L表达载体并检测了重组蛋白与血清抗体反应情况。利用KSHV ORF65、ORF73和ORFK8.1蛋白为抗原从蚌埠地区普通人群血清中筛查出阳性血清和阴性血清各32份。以ORFK12蛋白为抗原，用ELISA法筛查此64份血清，待测样品OD值高于Cut-Off值则判定为阳性，结果在32份经KSHV ORF65、ORF73和ORFK8.1蛋白为抗原筛查出的阳性血清中有10份的阳性血清OD值高于Cut-Off值即有反应，其中有22份没有反应，即用ORFK12基因表达的蛋白从普通人群中筛选出KSHV阳性血清明显有漏检情况［7］，说明ORFK12蛋白为抗原ELISA法筛查普通人群KSHV感染的灵敏度低。而经KSHV ORF65、ORF73和ORFK8.1蛋白为抗原筛查出的32份阴性血清OD值都低于Cut-Off值，这说明ORFK12蛋白为抗原的ELISA法筛查普通人群感染KSHV特异性很强。ORFK12蛋白虽然用于流行病调查存在一定的局限性，不足以用于KSHV的检测，但可以作为辅助检查，因为其ELISA的特异性良好。ORFK12基因编码的蛋白是潜伏期感染相关蛋白，有研究［12］表明ORFK12基因是诱导肿瘤形成的基因，卡波齐蛋白在90%艾滋病患者的KS中都表达，KSHV K12的表达对于KS发病具有较强的特异性。该研究通过验证ORFK12基因能够成功表达ORFK12蛋白，而且确定该蛋白与血清相应抗体有反应，为KSHV致病机制的研究提供了一定依据。

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Preliminary study of Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus ORFK12 protein

Wang Xiaowu，Zeng Xiancong，Chen Wei，et al
（Dept of Microbiology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo study the expression of ORFK12 gene of KSHV in E.coli and obtain KSHV seroprevalence in the general population in using the expressed protein.MethodsA pair of primers was designed to amplify ORFK12 gene by PCR，using the total DNA of BCBL-1 cells as template.Recombinant plasmid with the target gene was named PQE-80L-K12 and induced to express.In this study，antibodies to one protein of KSHV （ORFK12）were tested by indirect ELISA and Western blot.ResultsAfter using IPTG to induce express，PQE-80L-K12 recombinant bacteria had a fusion of 10 Ku protein by SDS-PAGE electrophoresis.10 specimens were tested.ConclusionIt is preliminarily proved that KSHV ORFK12 gene can express in E.coli，and ORFK12 protein infection KSHV plays certain supplementary role in laboratory tests.

Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus；ORFK12 gene；ORFK12 protein

R 373.4

1000－1492（2014）05－0565－04

2013－11－25接收

国家自然科学基金（编号：81271837）；安徽省教育厅自然科学基金（编号：KJ2012A161）；安徽医科大学博士科研经费资助项目（编号：XJ200914）

安徽医科大学微生物学教研室，合肥 230032

汪小五，女，硕士研究生；

王林定，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：wanglinding＠ahmu.edu.cn