溃疡性结肠炎患者外周血中MMP-2、MMP-9与肠黏膜通透性关系的临床研究

薛永举，梅 俏，丁 浩，胡 静，刘晓昌，许建明，胡乃中

溃疡性结肠炎患者外周血中MMP-2、MMP-9与肠黏膜通透性关系的临床研究

薛永举1，2，梅 俏1，丁 浩1，胡 静1，刘晓昌1，许建明1，胡乃中1

目的探讨溃疡性结肠炎（UC）患者中基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9水平与肠黏膜通透性的临床关联，为UC的发病机制及治疗提供可靠的参考指标。方法采用ELISA法检测38例UC患者（UC组）和30例正常对照者（正常对照组）外周血中MMP-2、MMP-9水平；采用高效液相色谱示差法检测UC组和正常对照组口服乳果糖（L）和甘露醇（M）测试液后尿液中L、M含量，计算L/M比值。结果UC组外周血中MMP-2、MMP-9水平显著高于正常对照组（P＜0.05）。UC组外周血中MMP-2、MMP-9水平与UC疾病严重程度及病变范围呈一定相关性；UC组患者尿中L/M比值显著高于正常对照组（P＜0.05），UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平与肠黏膜通透性改变有良好的相关性。结论活动期UC患者肠黏膜通透性增高，可能与外周血中MMP-2、MMP-9水平增高有关。

基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9；肠黏膜通透性；溃疡性结肠炎

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种反复发作的慢性非特异性肠道炎症性疾病，近年有研究［1］显示UC患者多存在不同程度的肠黏膜通透性增高的现象。且有研究［2］表明，肠黏膜通透性的改变可发生在肠道出现明显的炎性改变之前。UC的主要病理损伤涉及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的更新及结缔组织的重建。ECM是细胞附着的基本框架和代谢场所，其成分的降解与合成处于动态平衡状态，如平衡紊乱将导致器官的各种病理改变，如溃疡形成或器官纤维化［3－4］。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）裂解ECM成分，可通过降解内皮细胞间紧密连接引起血管内皮通透性增加，参与结肠黏膜损伤和并与结肠组织修复有关［5］。该研究通过检测UC患者外周血中MMP-2及MMP-9水平，并与UC患者的肠黏膜通透性及主要临床特征进行关联分析，以期为UC的发病机制及治疗提供可靠的参考指标。

1 材料与方法

1.1 研究对象选择2010年7月～2012年9月在安徽医科大学第一附属医院诊断为活动性UC患者38例（UC组），男20例，女18例，年龄21～70（34.7±10.3）岁，其诊断标准参考2007年《对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》［6］，排除标准如下：①排除其他自身免疫性疾病；②排除感染性结肠炎：痢疾杆菌感染，沙门氏菌感染、阿米巴感染、血吸虫感染及肠结核等；③排除克罗恩病、大肠癌、肝炎等；④排除真菌性肠炎、出血坏死性肠炎、过敏性紫癜、胶原性结肠炎、结肠憩室、HIV感染合并的结肠炎等。正常对照组30例，其中男16例，女14例，年龄24～59（37.6±8.9）岁。各组间在年龄、性别比较差异无统计学意义。

1.2 主要试剂人MMP-2、MMP-9酶联免疫检测试剂盒均购自美国R＆D公司；乳果糖及甘露醇标准品购自美国Sigma公司；乙腈（色谱纯）：美国天地公司产品；乳果糖口服液：荷兰苏威公司；20%甘露醇溶液：安徽双鹤药业股份有限公司。

1.3 主要仪器酶标仪RS-232：瑞士公司；Agilentl100系列高效液相色谱仪系列配置G1362A示差检测器（美国Agilent公司产品）；SB3200超声波清洗器（上海必能信超生有限公司产品）；Agilent色谱数据工作站：美国Agilent公司软件（2001-2008）。

1.4 方法

1.4.1 ELISA法检测MMP-2、MMP-9水平 研究对象均于清晨空腹平静状态下抽取5 ml肘静脉血，按试剂盒说明书采用双抗体夹心ELISA法检测血浆MMP-2、MMP-9的水平。

1.4.2 尿液标本收集 所有测试者前1 d晚上22时起禁食水，次日清晨空腹排空尿液后，口服L和M测试液各50 ml，此后禁水30 min、禁食2h，收集口服L和M后6h内全部尿液，取其中20 ml滴入2%硫柳汞2～4滴作防腐处理后，置－20℃保存待测［7］，后将冰冻贮存样品常温溶化、摇匀、离心10 min，以去除沉淀物后加入相应试剂后上机检测。

1.4.3 尿液中L和M浓度测定方法 采用HPLC示差法检测尿液中L和M浓度并进行方法学评价［7］。取所有研究对象1 ml尿液置于EP管中，予离心处理，离心时间10 min；吸取上清液，并加入100 ml乙腈沉淀蛋白，漩涡混合后再次离心、吸取上清液去离子处理后漩涡混合、离心、吸取上清液，最后使用水系滤膜过滤样品，色谱条件：Hypersil NH2柱（4.6 mm×250.0 mm，5μm），柱温设置为25℃，示差检测器：内加热32℃，进样检测乳果糖和甘露醇含量，乙腈、水（80∶20，V/V），流速1 ml/min［8］。

1.5 统计学处理采用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料采用±s表示，经方差齐性检验后，采用Pearson等级相关检验行相关性分析。

2 结果

2.1 UC组临床特征分析UC组患者中，按严重程度分类：轻度12例（32%），中度14例（36%），重度12例（32%）；按病变范围分类：全结肠炎12例（32%），左半结肠炎8例（21%），直乙状结肠炎9例（23%），直肠炎9例（24%）。

2.2 两组外周血MMP-2、MMP-9水平比较UC组外周血中MMP-2为（8.34±2.54）pg/L，MMP-9为（8.56±2.45）pg/L，正常对照组MMP-2为（1.91 ±0.30）pg/L，MMP-9为（2.14±0.31）pg/L，UC组MMP-2水平和MMP-9水平高于正常对照组（t＝2.414，P＜0.05；t＝2.576，P＜0.05）。

2.3 UC患者外周血MMP-2、MMP-9水平与主要临床特征的关联分析UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平与病变程度和病变范围均呈一定程度相关，差异有统计学意义（r＝0.692，P＜0.05；r＝0.661，P＜0.05），见表1。

2.4 两组L/M比值测定UC组的L和M排出的比值（0.057±0.020）与正常对照组的L和M排出比值（0.030±0.005）相比显著升高（P＜0.05），表明UC患者肠黏膜通透性明显增高。

2.5 UC患者的L/M测定与主要临床特征的关联分析UC患者L/M水平与病变程度和病变范围均呈一定程度相关，差异有统计学意义（r＝0.794，P＜0.05；r＝0.728，P＜0.05），见表2。

2.6 UC组患者外周血MMP-2、MMP-9水平与L/M比值关联分析UC组患者外周血MMP-2、MMP-9水平与其L/M比值呈一定程度相关，差异有统计学意义（r＝0.844，P＜0.05；r＝0.861，P＜0.05）。

表1 UC组患者血MMP-2、MMP-9水平与临床特征分析（±s）

表1 UC组患者血MMP-2、MMP-9水平与临床特征分析（±s）

临床特征nMMP-2（pg/L）P值F值MMP-9（pg/L）P值F值严重程度0.005147.90.007 199.49轻度124.07±0.705.39±0.51中度146.12±0.438.25±0.54重度1210.66±1.511.47±1.08病变范围0.013 226.280.019 208.35全结肠炎1212.37±1.1213.11±1.07左半结肠炎89.56±0.549.41±0.53直乙状结肠炎96.31±0.617.28±0.28直肠炎94.14±0.415.51±0.64

表2 活动期UC患者L/M比值与临床特征分析（±s）

表2 活动期UC患者L/M比值与临床特征分析（±s）

临床特征nL/M比值P值严重程度＜0.05轻度120.032±0.008中度140.049±0.011重度120.067±0.014病变范围＜0.05全结肠炎120.070±0.009左半结肠炎80.062±0.006直乙状结肠炎90.043±0.009直肠炎90.031±0.005

3 讨论

MMPs是降解ECM成分的蛋白水解酶，MMPs的活性增加可能会导致结肠的上皮损伤，在与炎症有关的组织破坏和重构中发挥了重要作用［9］。近年来有研究［10］显示，MMPs在UC的病理生理过程中发挥重要作用。MMP-2和MMP-9在UC中主要降解Ⅳ型胶原，Ⅳ型胶原是基底膜主要成分，作为屏障起到阻止炎症扩散作用［11］。Garg et al［12］发现在炎症性肠病（IBD）中MMP-9通过调节杯状细胞减弱黏膜防御引起结肠炎症。Meijer et al［13］检测122例克隆恩病（Crohn＇s disease，CD）患者、20例UC患者及62例正常人回结肠标本MMPs及TIMPs水平，发现MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9及TIMP-1、TIMP-2水平在CD和UC患者中均有明显增高，且MMPs水平与结肠中髓过氧化物酶水平呈正相关。国内研究［14］表明，MMP-2在UC患者病变组织中呈高表达。Von Lampe et al［15］检测21例UC患者和21例CD患者结肠活检标本中MMPs及TIMPs mRNAs表达，发现UC和CD中MMP-2、MMP-1、MMP-4及TIMP-1 mRNAs表达显著增加，表明MMPs在IBD的结肠组织破坏和重构中发挥重要作用。

本研究结果表明UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平明显高于正常对照组，提示MMP-2、MMP-9可能参与UC的病理生理机制。通过UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平与UC主要临床特征的关联分析，发现重度活动期UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平明显高于中度患者，同时不同病变范围的活动期IBD患者间MMP-2、MMP-9水平存在一定差别，表明活动期UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平与疾病严重程度、病变范围呈相关性。同时，外周血中MMP-2、MMP-9水平与肠黏膜通透性有良好相关性。

综上所述，活动期UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平明显增高，与UC严重程度和病变范围呈一定相关，提示MMP-2、MMP-9可能是肠黏膜通透性改变的关键分子，但参与UC发病及肠黏膜通透性改变还有很多其他重要的因素，有待于进一步研究。

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The relationship between the expression of matrix metalloproteinases and intestinal mucosal permeability in patients with ulcerative colitis

Xue Yongju1，2，Mei Qiao1，Ding Hao，et al
（1Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，The Key Laboratory for Digestive Diseases of Anhui Province，Hefei 230022；2Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233003）

ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of matrix metalloproteinases（MMPs）and intestinal mucosal permeability in patients with ulcerative colitis.Methods38 UC patients and 30healthy controls were enrolled in this study，the levels of MMP-2 and MMP-9 in the serum were assessed by ELISA method.Detected the lactulose and mannitol in urine of 38 UC patients and 30healthy people after they took orally the lactulose and mannitol test solution by HPLC-RI method and calculated the ratio of them.ResultsThe serum levels of MMP-2 and MMP-9 in UC patients were significantlyhigher than that inhealthy controls，which were correlated with the severity and extent of disease（P＜0.05）.The lactulose/mannitol ratio in 38 UC patients was signifi-cantlyhigher than that in 30 control people.The serum levels of MMP-2 and MMP-9 in UC patients were correlated with the the change of intestinal mucosal permeability.ConclusionThe serum levels of MMP-2 and MMP-9 in UC patients are significantly increased，which is correlated with the change of intestinal mucosal permeability.

MMP-2；MMP-9；ulcerative colitis；intestinal mucosal permeability

R 574.1

A

1000－1492（2014）04－0495－04

2013－11－25接收

安徽省自然科学基金（编号：09020103010）

1安徽医科大学第一附属医院消化内科，安徽省消化病重点实验室，合肥 230001

2蚌埠医学院第一附属医院消化内科，蚌埠 233003

薛永举，男，主治医师；梅 俏，男，博士，副教授，副主任医师，责任作者，E-mail：meiqiao＠hotmail.com