200 mmol/LHS对严重烫伤大鼠肠组织氧化应激及PBMCs中p38MAPK活性的影响

高 智，吴雪生，孙业祥，陈旭林，王 飞

200 mmol/LHS对严重烫伤大鼠肠组织氧化应激及PBMCs中p38MAPK活性的影响

高 智1，吴雪生2，孙业祥1，陈旭林1，王 飞1

目的探讨200 mmol/L高渗盐液（HS）对严重烫伤大鼠肠组织的氧化应激以及外周血单个核细胞（PBMCs）中的p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）活性的影响。方法按照随机抽样法将SD大鼠划分为3组：对照组（8只）、乳酸钠林格液组（LR组，24只）以及高渗盐液组（HS组，24只）。烫伤前48h 3组大鼠均予以颈静脉置管，对照组的大鼠直接处死取材。LR组和HS组的大鼠在经过30%体表面积烫伤（TBSA）后分别予补充LR与HS进行复苏治疗，并分别于烫伤补液后2、8、24h处死取材。检测3组大鼠肠组织中髓过氧化物酶（MPO）的活性与丙二醛（MDA）的含量，分离各组的PBMCs并采用Western blot法检测细胞中p38MAPK的活性，将所得数据进行统计学分析。结果与对照组相比，HS组及LR组肠组织中MPO活性和MDA含量明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），HS组与LR组相比伤后各时间点上肠组织MPO活性与MDA含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），而HS组和对照组相比伤后3个时间点上肠组织MPO活性与MDA含量无明显区别，差异无统计学意义（P＞0.05）。HS组与LR组复苏后各时间点PBMCs中的p38MAPK活性表达与对照组比较显著增强，差异有统计学意义（P＜0.01），但LR组和HS组进行比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论使用200 mmol/L的HS进行液体复苏较LR能明显减轻严重烫伤大鼠肠组织的氧化应激反应，两组对PBMCs中的p38MAPK活性表达无差异。

烧伤休克；高渗盐；髓过氧化物酶；丙二醛；p38丝裂原活化蛋白激酶

适量的液体复苏对于严重烧伤患者的存活十分重要，尤其是烧伤体表面积超过50%的患者［1］。乳酸钠林格液（lactate Ringer＇s solution，LR）由于其各种电解质含量均接近细胞外液，在临床上被广泛使用。然而，有研究［2］显示，使用LR对严重烧伤进行复苏治疗，经常会导致补液过度，并由此引发一系列并发症。为此，有研究者开始单独或者联合胶体使用高渗盐液（hypertonic sodium solution，HS）对烧伤进行复苏治疗，发现能减少因为补液导致的并发症［3］。肠道是严重烧伤早期最易受伤的脏器之一，该文通过比较200 mmol/L的HS和LR对严重烫伤大鼠进行液体复苏治疗，观察其对严重烫伤大鼠肠组织氧化应激反应以及外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中的p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK）活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 56只SD大鼠，普通级，性别无限制，体重250～350 g。动物均购于安徽医科大学动物实验中心，购置后正常饲养1周。

1.1.2 HS的制作 配置1 L的200 mmol/L HS需要LR 955.41 ml与10%NaCl 44.59 ml。溶液中含钠量为200 mmol/L，氯180 mmol/L，钾3.8 mmol/L，钙2.9 mmol/L。

1.1.3 试剂盒 髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒均购于南京建成生物工程研究。

1.2 实验方法

1.2.1 烫伤模型制作 所有大鼠在烫伤前2 d，均给予全麻并颈外静脉置管（全麻药物：戊巴比妥30 mg/kg）。烫伤时先将大鼠全麻，剃除背部毛发，暴露背部皮肤并放入98℃的热水中浸浴12 s，以此制造出大鼠30%总体表面积（total body surface area，TBSA）Ⅲ度烫伤模型。

1.2.2 实验分组与补液 所有大鼠的颈静脉置管2 d后，随机分为3组：对照组（8只，未予烫伤直接解剖）、LR组（24只，烫伤后给予LR补液）、HS组（24只，烫伤后给予HS补液）。补液参照Pruitt公式［4］进行。

1.3 标本收集将对照组8只大鼠于颈静脉置管后2 d处死，LR组和HS组分别在烫伤后2、8、24h各取8只大鼠进行解剖。收集3组大鼠腹主动脉血以及小肠组织（距离胃幽门4 cm）。于腹主动脉血中提取出血单个核细胞并置于－80℃低温冰箱中储存。将取出的小肠组织迅速液氮冷冻置于－80℃低温冰箱中储存。

1.4 观测指标

1.4.1 肠组织MPO活性的检测 将冷冻的肠组织取出，在生理盐水中按照重量体积比1∶10进行解冻混匀，匀浆按照1∶1进行稀释。之后将得到的样本按照厂家说明，使用中国上海生产的721分光光度计进行检测MPO分析盒样本在460 nm的吸光度。根据在37℃下分解每克肠组织消耗了1 μmol的过氧化氢所需的MPO量得出一个单位的MPO活性。

1.4.2 肠组织MDA含量的检测 使用MDA试剂盒测定肠组织MDA含量。将冷冻的肠组织置于冰浴器内在生理盐水中按照重量体积比1∶10进行混匀。均浆在4℃下按照900 r/min离心10 min。严格按照制造商的说明测量上清液中的MDA含量并使用分光光度计测量标本在532 nm下的吸光度。上清液中的蛋白浓度使用染色法进行测量，MDA含量用每毫克蛋白所含MDA纳米摩尔数进行描述。

1.4.3 PBMCs的分离与p38 MAPK活性的检测将冷冻的PBMCs取出后复苏并用冷的细胞裂解缓冲液进行细胞溶解。溶解产物在冰上孵育15 min，在1 400 r/min下离心15 min，收集上清液用于分析。蛋白提取物（40 μg）通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离，并电泳转移至硝酸纤维素膜上。该膜在程序阻止后，先使用p38和p-p38的初级抗体（美国圣克鲁斯生物工程公司）进行免疫印迹，后在4℃的温度下放置一夜，后加入第二抗体孵育。免疫反应阳性的条带用ECL免疫印迹检测系统（英国安玛西亚公司）进行检测。

1.5 统计学处理采用SPSS 19.0统计软件分析，所得资料以±s表示，实验中3组间的数据按照单因素方差法（ANOVA）进行分析，LR组与HS组各时相点间比较采用t检验进行处理。

2 结果

2.1 200 mmol/L的HS能减低严重烫伤大鼠肠组织的MPO活性LR组各时间点肠组织的MPO活性与对照组比较有显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；而对照组中肠组织MPO活性与对应的HS组相比，差异无统计学意义；HS组各时间点MPO活性与LR组比较有显著减低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。ANOVA的F值为7.833，t检验的2、8及24h的t值分别为7.155、2.417及2.441，见图1。

图1 200 mmol/L HS对严重烫伤大鼠肠组织MPO活性的影响

2.2 200 mmol/L的HS能减少严重烫伤大鼠肠组织的MDA含量LR组各时间点肠组织的MDA含量与对照组比较有显著性增高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；而对照组中肠组织MPO活性与对应的HS组相比，差异无统计学意义；HS组各时间点MDA含量与LR组比较有显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。ANOVA的F值为6.025，t检验的2、8及24h的t值分别为2.522、2.678及3.161，见图2。

图2 200 mmol/L HS对严重烫伤大鼠肠组织MDA含量的影响

2.3 200 mmol/L的HS对严重烫伤大鼠PBMCs中p38MAPK活性的影响烧伤后PBMCs中的p38MAPK活性明显增强，LR组与HS组在相应的3个时间点上与对照组相比p38MAPK活性表达均明显增强（P＜0.01），而对比HS组与LR组3个时间点上的PBMCs中p38MAPK活性含量比较差异无统计学意义。ANOVA的F值为13.901，t检验的2、8及24h的t值分别为0.037、1.100及－1.239，见图3。

图3 200 mmol/L HS对严重烫伤大鼠PBMCs中p38MAPK活性的影响

3 讨论

严重烧伤后，由于大面积皮肤组织的坏死以及毛细血管通透性的增加使大量体液丢失，导致患者较早发生休克。烧伤休克能引发组织缺氧并影响钠ATP酶泵的功能，这使得大量的钠离子进入到细胞内，降低了细胞外的晶体渗透压，细胞水肿明显，进一步加重了低血容量［5］。钠离子内移引起的低钠血症将进一步加重组织细胞水肿，甚至导致器官功能障碍。因此，适当地使用HS有助于减轻组织细胞水肿，防止医源性并发症。前期的研究［4］显示使用200 mmol/L的HS复苏休克较LR能明显减轻肺水肿以及阻止低钠血症的发生。

严重烧伤后，机体迅速发生应激反应，中性粒细胞聚集，氧自由基的产生增加，并通过脂质过氧化反应，引发细胞膜的氧化损伤最终致使细胞坏死［6］。对于肠组织主要表现为组织缺血缺氧，黏膜屏障受损，大量的中性粒细胞被激活聚集到肠组织中，由此大量产生的MPO打破了氧化与抗氧化物质平衡引起肠道损伤。国外相关研究［7］表明与LR比较，使用HS复苏休克可降低组织中MPO的含量，提高患者的生存率。严重烧伤后体内氧自由基含量增加，各组织器官中的MDA的含量也明显升高［8］。因此，肠组织均浆中MDA的浓度可以评估肠组织中氧自由基释放所引发的细胞损伤程度。在比较LR组和HS组数据后，发现200 mmol/L的HS能明显降低严重烧伤后大鼠肠组织中的MPO活性以及MDA浓度，表明使用200 mmol/L的HS复苏能减轻肠组织缺血缺氧后的中性粒细胞浸润、氧化应激反应与细胞损伤。最近研究［9］显示输注适量的HS（365 mOsm/L）较等渗盐溶液能明显减轻大鼠肠缺血后的缺血再灌注损伤。

PBMCs是产生肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）等细胞因子的主要免疫细胞，在烧伤与创伤后早期的全身炎症反应中发挥重要的作用。p38MAPK是人体内MAPK通道中的最重要的分支之一，激活p38信号转导通路是许多蛋白质诱导炎症过程以及调控细胞因子分泌的关键因素［10］。因此，测定PBMCs中的p38MAPK可以了解严重烫伤后大鼠的早期全身炎症反应的关键环节。薛丽等［11］研究发现，HS（719 mmol/L）对失血性休克大鼠复苏与等渗盐水比较，T淋巴细胞的p38MAPK表达显著降低。通过使用200 mmol/L的HS对严重烫伤大鼠复苏与LR复苏比较，发现两者PBMCs中的p38MAPK活性表达无显著差异，这可能与所使用的HS浓度（200 mmol/L）有关。

总之，与LR比较，使用200 mmol/L的HS复苏能有效减轻严重烫伤大鼠肠组织的氧化应激反应，其保护作用主要是通过减少中性粒细胞在肠组织的聚集和有效减缓肠组织中氧自由基的大量释放。对于烧伤后PBMCs中的p38MAPK活性表达的影响，两者没有显著差异，有待进一步研究。

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Effect of 200 mmol/L Na＋hypertonic saline resuscitation on oxidative stress of intestinal tissue and p38MAPK expression of PBMCs in severely burned rats

Gao Zhi1，Wu Xuesheng2，Sun Yexiang1，et al
（1Dept of Burns，2Dept of Emergency Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo study the effect of 200 mmol/L Na＋hypertonic saline resuscitation on oxidative stress of intestinal tissue and p38MAPK expression of peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）in severely burned rats.MethodsFifty-six SD rats were randomly divided into three groups：control group，sodium lactate Ringer＇s solution group（LR group）andhypertonic sodium solution group（HS group）.Neck vein catheterization was used on all rats，and burn resuscitation therapy was adopted in the rats of LR group and HS group.The myeloperoxidase（MPO）activity and malondialdehyde（MDA）content of intestinal tissue were measured in three groups.PBMCs were isolated and the p38MAPK expression was determined by Western blot analysis.The data drawn from the test were statistically analyzed.ResultsThe MPO activity and MDA content of intestinal tissue at each time point after resuscitation between HS group and LR group were significantlyhigher than those of the control group（P＜0.05，P＜0.01）.The MPO activity and MDA content of intestinal tissue at each time point after resuscitation in HS group were significantly lower than those of the LR group（P＜0.05，P＜0.01），which compared with the control group，the difference was not statistically significant（P＞0.05）.The p38MAPK expressions of PBMCs at 2，8，24h after fluid resuscitation between LR group and HS group were significantly expressed in comparison with the control group（P＜0.01）.Theyhad no obviously difference between LR group and HS group（P＞0.05）.ConclusionCompared with sodium lactate Ringer＇s solution，200 mmol/L Na＋hypertonic saline resuscitation can attenuate oxidative stress of intestinal tissue in severely burned rats，but not affect the p38MAPK expression of PBMCs in severely burned rats.

burns shock；hypertonic saline；MPO；MDA；p38MAPK

R 644；R 605.971；R 392-33

A

1000－1492（2014）04－0439－04

2014－01－05接收

安徽省高等学校省级自然科学基金（编号：KJ2008B298）；国家自然科学基金（编号：81272092）

安徽医科大学第一附属医院1烧伤科、2急诊外科，合肥230022

高 智，男，硕士研究生；孙业祥，男，副教授，副主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：sunyexiang＠163.com