大理单刺仙人掌提取物抑菌效果及抑菌机理的初步探讨

黄 媛，张鹏程，杨 康，陈冬菊，刘文英，张 雷

（大理学院基础医学院，云南大理 671000）

大理单刺仙人掌提取物抑菌效果及抑菌机理的初步探讨

黄 媛，张鹏程，杨 康，陈冬菊，刘文英，张 雷*

（大理学院基础医学院，云南大理 671000）

目的:探讨大理地区单刺仙人掌乙醇提取物和超声波提取物的体外抑菌效果及其抑菌机制。方法:以乙醇提取法和超声波提取法提取仙人掌原液，用K-B法分别测仙人掌提取物对标准株金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白色念珠菌标准株的抑菌效果，以常量稀释法检测其最低抑菌浓度，并以抑菌曲线初步探讨其抑菌机制。结果:两种方法提取的仙人掌原液对实验菌株均有抑制作用，乙醇提取物的最低抑菌浓度小于超声波提取物。抑菌曲线表明，乙醇提取物原液在金黄色葡萄球菌生长的9 h内均表现出抑制作用。结论:大理地区的单刺仙人掌两种提取物对本实验的革兰阳性菌和革兰阴性菌及真菌均有抑制作用，其中乙醇提取物的抑菌效果较超声波提取物好。本研究可为仙人掌提取物的进一步研究和应用打下理论基础。

单刺仙人掌提取物；K-B法；最低抑菌浓度（MIC）；抑菌曲线；抑菌效果；抑菌机理

近年来，随着抗生素的不合理使用，临床耐药菌株不断增加，细菌及真菌的耐药性增强，致使临床感染病死率不断增高。我国中草药资源丰富，种类繁多，许多中草药具有抗细菌和真菌感染的药效，且不易产生耐药性，抗菌谱广，毒副作用小，具有很好的发展前景〔1〕。在祖国传统医学中，仙人掌类植物作为药用已有悠久的历史，并已作为中药材列入我国《中药大词典》。仙人掌为健胃滋养强壮剂，又可以补脾、镇咳、安神，治心胃气痛、浮肿等〔2-3〕。本实验以大理地区的单刺仙人掌（Opuntic monacantha）为原料，进行仙人掌粗提取物对几种常见致病菌的抑菌作用和抑菌机制的初步研究，为开发和有效利用仙人掌资源奠定一定的基础。

1 材料与仪器

1.1实验菌株标准菌株为金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、大肠埃希菌（ATCC25922）和白色念珠菌（ATCC90029）标准株；大理单刺仙人掌由小组成员赴大理市下关凤仪镇采集，并由大理学院药化学院生药教研室段宝忠副教授鉴定。

1.2实验试剂营养琼脂（批号：111007），MH琼脂（批号：20021101），MH肉汤（批号：20020903），沙保弱培养基（批号：20070227）等；以上试剂均由杭州天和微生物试剂有限公司生产。

1.3主要仪器真空冷冻干燥器（日本EYELA东京理化器械株式会社，FDU-2100）；生化培养箱（常州维嘉仪器，WJ-250B）；高速中药粉碎机（DFY-600）；低速平衡离心机（北京医用离心机厂，LDZ5-2）；立式高压灭菌器（上海博讯，YXQ-LS-50S）；旋转蒸发仪（上海蓝旭，RE-2000）；干燥箱（上海市崇明实验仪器厂，101C-2CB）等。

2 实验方法

2.1乙醇提取法制备仙人掌原液称取2 kg大理单刺仙人掌，去刺洗净切条后置于烘烤箱中60℃，96 h，烘干后粉碎。取仙人掌干粉100 g，加250 mL 80%的乙醇，充分振荡，浸泡40 h后取上清液，滤渣中再加入150 mL 80%的乙醇，再次振荡，浸泡48 h，取上清液，合并2次上清液后进行减压抽滤，将滤液减压浓缩后进行冷冻干燥，获得仙人掌固体提取物10.61 g，密封储存于4℃冰箱，备用〔4〕。

2.2超声波提取法制备仙人掌原液取仙人掌粉末20 g用80%的乙醇以1 g∶20 mL的固液比例浸泡6 h，之后用超声波（频率70 kHz放射1 s，间歇1 s），作用于浸泡液20 min，过滤后，将滤渣再次加入80%乙醇400 mL，超声波作用20 min，过滤，合并2次滤液，4℃冰箱过夜，次日用离心机4 500 r∕min，离心10 min，取上清液，真空冷冻干燥后，获得超声波仙人掌提取物3.45 g，密封储存于4℃冰箱，备用〔5〕。

2.3药物纸片制备将直径为6.35 mm吸水量为20 μL的圆形滤纸片，放入EP管中置于立式高压灭菌器中121℃下灭菌30 min后，制成含仙人掌提取物0.024 g的药物滤纸片〔6〕。用75%乙醇浸泡的滤纸片作空白对照。

2.4体外抑菌试验制备0.5麦氏单位的菌悬液，以K-B法〔7〕分别检测仙人掌超声波提取物和乙醇提取物对标准株ATCC 25293、ATCC25922、和ATCC90029的抑菌作用。

2.5最小抑菌浓度（MIC）测定采用常量稀释法〔7-8〕，分别检测仙人掌超声波和乙醇提取物对标准株ATCC25293、ATCC25922和ATCC90029的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

2.6抑菌曲线的研究用MH液体培养基将仙人掌乙醇提取物稀释成含生药0.012 5 g∕mL，分别加入0.5麦氏单位的ATCC25293，使药液含菌量为107CFU∕mL，置于摇床200 r∕min，37℃培养，对照（含ATCC25293）不加药物培养。分别于0、3、6、9 h各取样100 uL。用酶标仪分别检测A600值，以A600作为纵坐标，以培养时间为横坐标，利用Excel绘制仙人掌乙醇提取物对ATCC25293的抑菌曲线。

3 结果

3.1 K-B法检测体外抑菌效果仙人掌乙醇提取物和超声波提取物ATCC25923、ATCC25922和ATCC90029的体外抑菌结果表明：乙醇提取法优于超声波提取法；乙醇提取物对细菌的抑菌作用强于真菌。见表1。

表1 仙人掌80%的乙醇提取物与超声波提取物抑菌效果

3.2常量稀释法检测MIC以常量稀释法检测仙人掌乙醇提取物和超声波提取物对ATCC25923、ATCC25922和ATCC90029的MIC。结果表明：两种仙人掌提取物均有抑菌效果，其中80%乙醇提取法所得提取物对金黄色葡萄球菌的MIC小于大肠埃希菌。见表2。

表2 仙人掌80%乙醇提取物与仙人掌超声波提取物的MIC

3.3仙人掌提取物抑菌曲线绘制仙人掌80%乙醇提取物对ATCC25923的抑菌曲线，结果表明：仙人掌乙醇提取物在金黄色葡萄球菌生长的0～9 h均表现出抑制作用。见图1。

图1 仙人掌乙醇提取物对ATCC25923的抑菌曲线

4 讨论

本研究选用金黄色葡萄球菌（ATCC25923）为革兰阳性菌代表，大肠埃希菌标准株（ATCC25922）为革兰阴性菌代表，选用白色念珠菌（ATCC90029）为真菌的代表，对仙人掌提取物的研究结果表明：乙醇提取物的抑菌效果比超声波提取物好，两种仙人掌提取物对实验中的革兰阳性菌和革兰阴性菌以及真菌均有抑菌活性，其中对革兰阳性菌和革兰阴性菌的抑制作用强于真菌，这与已有研究结果一致〔9-10〕。

天然产物提取物的抑菌机理主要为以下几种类型：①抑制核酸的形成；②抑制蛋白质的合成；③改变细胞膜的通透性；④干扰细胞壁的形成；⑤作用于能量代谢系统和作为抗代谢物。对于作用于细胞壁的抗菌物质，微生物同样也会产生一系列应激反应，已有研究发现真菌细胞在处理外界酶或其它环境因素（温度、pH、化学物质、渗透压等）对细胞壁的破坏作用时，可激活一系列酶反应，以检测细胞壁受到的破坏并将其信息传输到细胞核，最后增加几丁质合成，促进β-1，3葡聚糖聚合酶的表达，并促进细胞壁蛋白质的合成〔11〕。已知真菌细胞壁的主要成分是几丁质，而细菌细胞壁主要成分是肽聚糖。当受到药物作用时，真菌细胞可产生的应激反应，以增加几丁质的合成，并促进真菌细胞壁的合成，增加真菌细胞壁的密度和厚度，这可能是导致本实验中仙人掌提取物对真菌的抑制作用弱于细菌的原因。

在仙人掌抑菌曲线的研究中，发现乙醇提取物在金黄色葡萄球菌生长的0～9 h均表现出抑制作用，说明乙醇提取物在细菌生长的前期有一定的抑制作用。一般而言，细菌生长的前期包括迟缓期和对数期，迟缓期的细菌正在为下一步对数期的二分裂准备必须的酶及大分子前体物质，因而仙人掌乙醇提取物抑菌机制可能是由于其能抑制金黄色葡萄球菌在迟缓期的大分子前体物质的合成，并可能抑制或破坏进入对数期的菌体二分裂所需的蛋白或酶类，因而在细菌生长前期表现出抑制作用。本研究为仙人掌抑菌制品的进一步加工及其在药用和仙人掌保健品开发方面提供了实践依据。

感谢大理学院基础医学院病原生物学综合实验室孟余老师、药化学院有机化学实验室李龙星老师和段宝忠老师对本研究提供的帮助和支持。

〔1〕何明，张永跟.中药抑菌作用研究现状〔J〕.北京中医药大学学报：中医临床版，2007，14（6）:44-46.

〔2〕文雯，李梁.仙人掌的药用功效及有效成分提取的研究进展〔J〕.保鲜与加工，2011，11（5）:47-50.

〔3〕杨宁.仙人掌多糖的分离纯化及降血糖的研究〔D〕.广东：华南理工大学，2007.

〔4〕赵声兰，陈朝银，段家贵.仙人掌提取物的抑菌作用研究〔J〕.食品工业科技，2003，24（5）:40-43.

〔5〕韩淑琴.提取仙人掌抑菌物质三种方法的比较〔J〕.食品与药品，2009，11（4）:41-43.

〔6〕缪晓平，邓开野.仙人掌中抑菌活性成分的提取与分析〔J〕.河南工业大学学报，2010，31（6）:58-61.

〔7〕倪语星，尚红.临床微生物学与检验〔M〕.北京：人民卫生出版社，2011：58-63.

〔8〕孟小亮，田甜，贺中华，等.MIC法测定9种抗生素对不同血清型副溶血弧菌的抑菌作用〔J〕.齐鲁渔业，2009（6）：23-25.

〔9〕姜成，申晓慧，李春丰，等.仙人掌提取物抑菌作用的研究〔J〕.内蒙古农业科技，2013（3）:38-39.

〔10〕余中华，赵超，贾德峰，等.仙人掌不同提取物的抑菌效果〔J〕.热带作物学报，2008，29（2）:237-242.

〔11〕KAPTEYN J C，VAN DEN ENDE H，KLIS F M.The con⁃tribution of cell wall proteins to the organization of the yeast cell wall〔J〕.Biochim Biophys Acta，1999，1426（2）:373-83.

*通信作者：张雷，教授，博士.

（责任编辑 李 杨）

Preliminary Study on the Antibacterial Effects and Mechanism of Opuntia monacantha Extracts in Dali

HUANG Yuan,ZHANG Pengcheng,YANG Kang,CHEN Dongju,LIU Wenying,ZHANG Lei*
（Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the antibacterial effects and mechanism in vitro of the ethanol extracts and ultrasonic extracts of Opuntic monacantha in Dali.Methods:Ethanol extraction and ultrasonic extraction were respectively applied to the preparation of primary extracts of Opuntia monacantha,and antibacterial effects on experimental strains Staphylococcus aureus,Escherichia coli and Candida albicans were detected by using K-B method.The minimum inhibitory concentrations(MIC)were measured by the macro dilution method,and the antibacterial mechanism was preliminarily explored by the antibacterial curve.Results:There are inhibitory effects in two kinds of primary extracts on experimental strains.The MIC of ethanol extracts were lower than that of ultrasonic extracts. Antibacterial curve demonstrated that the ethanol extracts of Opuntic monacantha had antibacterial effects on Staphylococcus aureus within 9 hours of growth.Conclusion:Two kinds of extracts of Opuntic monacantha in Dali were able to inhibit the growth of experimental strains including gram-negative and gram-positive bacteria and fungi;antimicrobial effects of ethanol extracts were better than those of ultrasonic extracts.This study could provide a theoretic basis for further research on and application of the extracts of Opuntia monacantha.

Opuntia monacantha extracts;K-B method;minimum inhibition concentration(MIC);antibacterial curve;antimicrobial effect;antibacterial mechanism

S682.33

A

1672-2345（2014）08-0015-03

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.08.005

大理学院大学生科研基金资助项目（KYSX2012004）

2014-03-06

2014-04-18

黄媛，临床医学专业2010级本科生.