“中药色谱分析综合实验”创新课程教学探索

周婷婷， 闻 俊， 赵卫权， 洪战英， 赵 鑫， 范国荣

(1. 第二军医大学 药学院，上海 200433；2. 上海市药物(中药)代谢产物研究重点实验室，上海 200433)

0 引 言

分析化学是关于研究物质的组成、含量、结构和形态等化学信息的分析方法及相关理论的一门科学，其理论知识和实验技能是药物分析学、药物化学、天然药物化学、中药学等各个学科的必备基础，是药学专业基础化学课程之一[1]。分析化学以解决实际问题为目的，实践性、应用性较强，因此配合理论教学所开设的分析化学实验可以巩固加深学生对分析化学基本概念和理论的理解，同时又使得学生可以运用所学的知识指导实验过程、解释实验现象和解决实验中的问题，做到理论联系实际。

针对药学专业学生的分析化学教学，多采用药物为对象进行理论和实验讲授，以在低年级阶段让学生接触药物的概念，尽早的强化学生药学专业思想，即所学的理论知识与实验技术是用来解决药物研究的实际问题。从这个角度出发，实验教学不应该全部以独立的实验项目进行训练，可以采用模块化的实验教学形式，以解决实际问题为目的，合理进行教学设计，有机组合实验技术，突出科学实践过程，在训练学生实验技能的基础上，有效的训练学生科研思维，增加学生专业兴趣[2-4]。因此，我们改进了色谱分析实验教学内容，建立了以“中药有效成分提取分离及分析”为主的色谱分析模块的综合实验，并且在近7届学生中进行了教学实践加以不断完善，达到了较好的教学效果，构建了以提高学生分析问题、解决问题能力和增加专业学习兴趣的模块化实验教学新模式。

1 色谱分析教学模块

分析化学中色谱分析教学模块主要由色谱分析概论、气相色谱法、高效液相色谱法、平面色谱法组成，其中概论部分以经典的柱色谱为例，讲授了色谱流出曲线、分离机制和色谱基本理论；各论中以各个色谱法的原理与应用特点为主进行讲解。“是什么？能做什么？”是教师通过课堂教学后，期望告诉学生的内容。其中“能做什么？”的答案则是以模块化的中药色谱分析为面貌展现在学生面前，结合理论课中“是什么？”的原理探讨，使学生在实验中增加对仪器使用和方法应用的直观认知过程[5-6]。

根据理论课教学中需要掌握的方法原理与实验技术，我们将色谱实验分为柱色谱法、薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法4个实验项目。模块化的综合实验则是基于中药分析这一实验过程提出的，中药分析中如何将上述4种实验技术有机结合，在教学设计中需要老师仔细考虑。根据教学组多年来“科研反哺教学”这一教学理念，结合教研室在中药质量控制中的研究技术与科研成果[7-14]，我们提出以“中药有效成分提取分离及分析”为实验教学要求的中药色谱分析综合实验，形成了“柱色谱法分离纯化中药有效部位”，“薄层色谱法鉴识粗提物及有效部位中活性成分”，“气相色谱法检查有效部位中有机溶剂残留量”，“高效液相色谱法测定有效部位及药材中活性成分含量”这4个前后联系，以解决中药分析问题为主线的创新型教学设计。创新的模块化实验教学不仅对4种色谱实验技术进行综合运用，而且还囊括了分离制备、定性和定量分析这些应用特点，同时也给学生一些科研实践的思考：柱色谱分离纯化过程对有效部位中活性成分含量是否有影响？有机溶剂残留主要和哪几个步骤有关？有效部位和药材中活性成分含量为何会有不同？这些都能够激发学生的探求欲和主观能动性，初步具备实践研究的思维特点。

2 药材及实验方法的综合选择

中药属于药物分析中的复杂体系，色谱法以其分离分析的特点，当仁不让的成为中药分析的首选方法。但是我国中药材种类丰富，其中所含的活性成分也千差万别，具体实验方法也不尽相同，因此教学组老师从自身科研角度出发，同时也综合考虑学生实验过程中的课时安排、仪器与试剂使用、对照品价格等问题，筛选了实验室研究较多的中药为对象，表1列出了该实验中选择的药材及实验方法。

学生实验与科研过程存在区别。如何在有限的教学时数、设备资源配置和教学经费投入中，获得预期的教学目标，提高教学质量，是教学设计者需要考虑的问题。在最初的实验教学中，我们分别在3个不同年级中尝试了采用辛夷、金莲花和山楂叶进行有效成分的分离纯化、定性定量分析。虽然整个教学过程可以完整的实施，但是其中的问题却反映出“科研反哺教学”这一理念在付诸实践时，还需要符合本科生的认知程度和实验教学的要求。

辛夷中的木脂素成分极性较小，采用大孔吸附树脂分离纯化，需要60%～90%的乙醇才能洗脱，柱色谱分离时间变长；为了保证高效液相色谱基线分离，针对松脂素二甲醚选择的流动相体系使得整个分析时间为30 min。金莲花和山楂叶纯化后的总黄酮有效部位中除了表1中所列主要活性成分外，还有较多的其他黄酮苷类成分，成分越多色谱方法优化就越复杂，条件也会更加苛刻。例如金莲花总黄酮有效部位中荭草苷定量分析，高效液相色谱流动相组成复杂，不仅学生配制过程容易出错，而且较长的分析周期也使得实验变得冗长。除此以外，对照品获得成本也需要考虑在实验中。由于学生实验需要自行配制工作曲线溶液，因此荭草苷与牡荆素鼠李糖苷化学对照品总量的成本显得相当高，而自制对照品的成本与周期也并不省时省力，从效率说上考虑，实验教学的有效性便大打折扣。

表1 中药色谱分析模块综合实验药材与主要实验方法

*气相色谱条件：色谱柱：SPB-1(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管柱，初始柱温50 ℃；程序升温：50 ℃恒温3 min，而后40 ℃/min升温至230 ℃，并维持5 min；进样口温度230 ℃；FID检测，检测器温度250 ℃；以高纯氮为载气，柱前压力为48 kPa，分流比为30∶1；溶液直接进样，进样量为0.5 μL

**色谱柱规格为150 mm×4.6 mm，5 μm，流速为1.0 mL/min，进样量20 μL；分析周期指“对照品”分析周期

相比之下，栀子纯化后得到的有效部位成分简单，其中栀子苷含量达到了60%以上，薄层色谱条件可以直接采用药典的方法，高效液相色谱法流动相组成简单，分析周期短。实验室拥有栀子苷单体制备的专利[13]，而且每个年级实验教学后收集的剩余有效部位经过进一步简单制备后又可以得到栀子苷对照品，如此循环利用不仅避免了药材浪费，还获得了更多的栀子苷对照品，使得实验教学具有可持续性。因此从药学本科2007年级开始至今，我们便选择栀子药材中总环烯醚萜苷类有效成分分离纯化和定性定量分析为教学内容，进行中药色谱分析模块综合实验教学，通过不断的完善，目前已经基本可以满足教学要求，取得了较大的教学效果。

3 实验设计

3.1 栀子中环烯醚萜苷类成分的提取及柱色谱法分离纯化

干燥栀子药材100 g，用10倍量50%乙醇80 ℃回流提取两次，每次2 h，过滤，合并滤液，40℃减压浓缩至120 mL，离心除去沉淀，得到含有栀子环烯醚萜苷有效部位的提取液(预留10 mL供以后实验使用)。上述步骤由老师提前完成。取剩余提取液，加入装有400 g经过预处理的1 300大孔吸附树脂层析柱上，上样完毕后吸附1 h。用1 000 mL水进行淋洗，淋洗液弃去。再用3 000 mL 20%乙醇洗脱，收集洗脱液减压浓缩，真空干燥(60 ℃)，得环烯醚萜苷有效部位固体产品。环烯醚萜苷有效部位得率=(固体产品重量÷药材重量)×100%。

实验采用内径为3 cm的玻璃柱，树脂填装应均匀紧密；上样时注意防止样品快速倾倒下冲起树脂产生柱内气泡，影响分离效果。运用乙醇密度计测定所配制的乙醇的浓度；淋洗及洗脱过程需要控制流速，一般为25～30 mL/min，防止流速太快造成淋洗或洗脱不完全，带入较多杂质，降低产品得率。

3.2 栀子中环烯醚萜苷类成分的薄层色谱法鉴别

取硅胶粉末5 g于研钵中，分多次加入0.5% CMC-Na溶液10 mL，每次加入后充分研匀，调成糊状，均匀涂布在玻璃板上，置水平台面上于室温下晾干，再在105 ℃烘箱中活化60 min，储于干燥器中备用。上述步骤在前一个实验的样品吸附1 h期间完成。

分别将栀子药材粗提液和有效部位用50%甲醇溶解并稀释成约相当于原药材200 mg/mL的供试品溶液，栀子苷对照品用乙醇溶解配制成约4 mg/mL的浓度，作为对照品溶液。取供试品溶液及对照品溶液，分别点于自制硅胶上，点样基线距薄层板底边2 cm，点样原点直径应小于2 mm，各样品原点之间间距1.5 cm以上，点样量约5 μL。另取市售硅胶板，同法操作。

按照乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)比例配制展开剂，倒入层析缸内，待点样后斑点溶剂挥干后，将薄层板放入层析缸内饱和15 min，而后将薄层板下缘浸入展开剂中约0.5～1 cm(展开剂切勿浸没样品原点)，展开约20～30 min后取出，标记展开剂前沿，放在空气中挥干。展开剂挥干后，喷以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃烘箱内加热至斑点清晰。

比较供试品和对照品展开后的斑点，测量计算Rf值。

3.3 高效液相色谱法测定栀子药材及其提取物中栀子苷的含量

配制500 ml流动相，比例为乙腈-1%醋酸水(15∶85)，色谱柱为ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，设置色谱仪条件为流速1.0 ml/min，室温，检测波长238 nm，进样量20 μl。

取栀子苷对照品，精密称定，用50%甲醇配制约1 mg/mL对照品储备液；取栀子苷储备液适量，置5 mL量瓶中，用流动相稀释并定容，制成浓度为10、20、40、60、80 μg/mL的栀子苷对照品工作曲线系列溶液。

精密量取栀子药材提取液适量，置10 mL量瓶中，用流动相稀释并定容；精密称定有效部位粉末适量，置10 mL量瓶中，用流动相稀释并定容，制成相当于原药材2 mg/mL的供试品溶液。临用前用0.45 μm微孔滤膜过滤。

在上述色谱条件下，依次进样工作曲线溶液，以对照品溶液的浓度(c)和相应的色谱峰面积(A)，拟合A-c工作曲线，求算回归方程及相关系数。进样供试品溶液，分别将色谱峰面积代入回归方程中，求算浓度，并进而求算药材及有效部位中栀子苷的含量，栀子苷经过大孔吸附树脂分离纯化后的得率。

3.4 气相色谱法检查栀子环烯醚萜苷类有效部位中的残留溶剂

气相色谱实验条件为色谱柱：SPB-1(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管柱，初始柱温50 ℃，程序升温：50 ℃恒温3 min，而后40 ℃/min升温至230 ℃，并维持5 min；进样口温度230 ℃；FID检测，检测器温度250 ℃；以高纯氮为载气，柱前压力为48 kPa，分流比为30∶11；溶液直接进样，进样量为0.5 μL。

精密称取乙醇、正丁醇适量，用N, N-二甲基甲酰胺为溶剂，分别配制乙醇与正丁醇储备液约10 mg/mL。分别量取上述二者储备液适量，置同一10 mL量瓶中，用N, N-二甲基甲酰胺稀释并定容，制成乙醇和正丁醇浓度均为0.5 mg/mL的对照品溶液。

精密称取栀子有效部位适量，置10 mL量瓶，并同时精密加入正丁醇储备液适量，用N, N-二甲基甲酰胺稀释并定容，制成栀子环烯醚萜苷有效部位0.1 g/mL和正丁醇0.5 mg/mL的供试品溶液。

按上述色谱条件进样检测，峰面积内标法计算栀子有效部位中乙醇残留量，检查有机溶剂残留是否符合标准。

4 实验实施

上述每个实验教学时间安排为4学时，根据实验室现有仪器设备数量，学生分组实施实验项目，每组5～8人为宜。按照中药有效成分提取分离、定性定量分析的顺序，所有小组同时开展实验，每次完成1个项目。每个实验组安排1名老师和1名高年级研究生带教，同时印发仪器使用基本操作规程，以帮助学生掌握色谱仪器的基本使用。

为了尽可能减少4个色谱实验以外的因素影响有效部位提取效率，结合实验教学时数安排，由老师在课前，根据学生分组个数，放大量统一完成栀子药材提取。学生柱色谱中获得的3 000 mL 20%乙醇洗脱液，则由老师在课后分别减压浓缩，制备成有效部位固体粉末，此粉末即为后续色谱分析实验的供试品之一，其得率由学生课堂内自行计算。

实验过程中强调认真记录原始记录，包括与柱色谱分离相关的洗脱液的体积和流速，淋洗及洗脱过程中层析柱上颜色的变化；薄层色谱法中点样体积、展开时间、点样原点到斑点的距离；高效液相色谱法中柱压的变化、分析对象的保留时间和峰面积；气相色谱法中载气、氢气和空气的压力及流速，温度变化与待测成分保留时间，色谱峰面积等。详实的记录一方面可以让学生了解色谱分析中的关键步骤，一方面便于在最后比较各组结果时，找出各组间结果不同的原因。

5 实验结果

以2010年级本科某组实验结果为例：100 g栀子果实药材，经过50%乙醇回流提取，并经过大孔吸附树脂分离纯化后得到棕色的环烯醚萜苷有效部位5.301 g。薄层色谱法鉴别结果显示，栀子果实粗提液及环烯醚萜苷有效部位的薄层色谱图中均显示与栀子苷位置相同，颜色相近的斑点，表明粗提液和有效部位中含有栀子苷。自制硅胶板与商品化硅胶板的结果一致。

采用高效液相色谱法测定栀子果实粗提液及环烯醚萜苷有效部位中栀子苷含量，在上述色谱条件下，栀子苷保留时间约为5.2 min，理论塔板数大于3 000。以栀子苷对照品溶液浓度(c，μg/mL)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，求得栀子苷的线性回归方程为：A=6 262c-288，r=0.999 9，表明栀子苷在10～80 μg/mL范围内线性关系良好。计算得出栀子果实药材中栀子苷含量为39.1 mg/g，环烯醚萜苷有效部位中栀子苷含量为591.7 mg/g，其中以栀子苷计算转移率为80.4%。采用气相色谱法测定环烯醚萜苷有效部位中乙醇残留量，采用内标峰面积比值法测定，有效部位中乙醇残留量小于0.5%，结果合格。

根据实验结果，教师要求每个同学按照期刊论文的格式撰写一篇研究论文，其中柱色谱分离纯化模块属于药材提取部分，必须写入论文，其余的3个模块则由同学自由选择组合后写入论文中。论文完成后学生还需要根据实验结果及实验过程中遇到的问题制作实验研究电子幻灯进行汇报，对中药提取分离及色谱定性、定量分析进行深入的探讨与交流。特别是针对实验结果与标准结果相差较大的实验小组，在汇报交流过程中与学生一起进行溯源式分析，提出可能影响结果的实验操作步骤，在对色谱综合分析具有直观而整体印象的基础上，再进行每个色谱技术的回顾，使专业知识的掌握与应用更加牢固。

6 结 语

中药色谱分析综合实验充分考虑了学生学习过程的需求，从色谱理论出发层层递进，以不同的色谱实验技术为手段，中药为研究对象，以解决实际问题为出发点，为本科生提供了一个全面而扎实的实验教学平台。特别是教学组在中药质量控制等科研工作上的优势积累，反哺于本科生的实验教学中[15]，在强化药学专业思想的同时，也使学生在类科研的环境中进行综合性实验，不仅训练了学生色谱分析的实验技能，而且提高了学生综合运用知识分析问题和解决问题的能力，更能够提升学生对专业领域内热点的兴趣，为今后专业课程的研修和实践，奠定了良好的理论基础与实验技能。

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