一种与胆固醇7，8位脱氢相关蛋白的表达研究

汤 睿，申雁冰，格日勒，牛丹丹，王 敏

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

一种与胆固醇7，8位脱氢相关蛋白的表达研究

汤 睿，申雁冰，格日勒，牛丹丹，王 敏

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

家蚕(Bombyx mori)的Nvd-Bm蛋白是一种与胆固醇7，8–脱氢酶相关的蛋白．根据NCBI中报道的家蚕中的胆固醇7，8–脱氢酶基因序列(GenBank登录号：AB232986.1)，采用密码子优化及基因克隆技术，扩增获得胆固醇7，8–脱氢酶目标基因nvd-Bm，并构建了重组穿梭载体pPIC9K-nvd-Bm，通过电转化，成功构建了含有pPIC9K-nvd-Bm的毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115异源真核表达工程菌株．经SDS-PAGE蛋白电泳分析表明，含有pPIC9K-nvd-Bm的毕赤酵母GS115表达菌株能够成功表达目标蛋白，为胆固醇的7，8–脱氢产物即7–脱氢胆固醇的生物转化奠定了基础．关键词：家蚕；胆固醇7，8–脱氢酶；密码子优化；毕赤酵母；诱导表达

维生素D是一种作用于钙、磷代谢的维生素[1]，它能够维持人及其他动物体内的血磷和血钙的平衡，促进骨质钙化以及肠道对钙磷等元素的吸收[2]．其中最重要的是维生素D2(麦角骨化醇)和维生素D3(胆钙化醇)．维生素D3在维生素D生物代谢中活性最高，主要由高级动物的表皮和真皮内含有的7–脱氢胆固醇经紫外线(波长265～228,nm)照射转变而成，也可来自如肝类、鱼肝油等动物组织中[3–5]．而7–脱氢胆醇主要由胆固醇经胆固醇7，8–脱氢酶作用转变生成，胆固醇7，8–脱氢酶是合成维生素D3的重要生物催化剂．

胆固醇7，8–脱氢酶主要参与蜕皮动物类固醇生物合成过程第一步重要反应，其主要功能是催化胆固醇转化为7–脱氢胆固醇．目前胆固醇7，8–脱氢酶在分子水平上的作用机制尚不清楚[6]．Yoshiyama等[7]发现，家蚕前胸腺中的neverland基因(nvd-Bm)与7，8–脱氢酶相关．通过RNA干扰和基因敲除技术获得的nvd-Bm缺失家蚕幼虫，其体内蜕皮激素的产生量明显降低而影响其生长，这一干扰可以通过补充7–脱氢胆固醇解除．夏小斌等[8]及Capyk等[9]在秀丽隐

杆线虫(Caenorhabditis elegans)中发现了功能类似的基因daf-36(GenBank登录号：NM_073228.4)，并证明该酶属于Rieske非血红素铁加氧酶，包含一段Rieske[2Fe-2S]区域以及一段非亚铁血红素关联区，可催化胆固醇转化为7–脱氢胆固醇，表明nvd-Bm基因具有编码胆固醇7，8–脱氢酶的作用．

目前，黄时海等[10]实现了基因nvd-Dm在大肠杆菌中的少量表达，表达效率偏低．本研究主要克隆了来自家蚕的nvd-Bm基因(GenBank登录号：AB232986.1)，采用密码子优化技术，构建了nvd-Bm基因的真核表达工程菌并实现了重组Nvd-Bm蛋白的高效表达．研究结果为进一步进行其与伴侣蛋白的共表达研究奠定了基础．

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115及pPIC9K载体均由本实验室保存；优化后的nvd-Bm基因及5’AOX1 / 3’AOX1引物，由金唯智公司合成．

引物5’AOX1的序列为：5′-GACTGGTTCCAAT TGACAAGC-3′；引物3’AOX1的序列为：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′．

1.2 培养基、酶及试剂

毕赤酵母GS115培养基的配制方法参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册；大肠杆菌DH5α的培养基采用LB培养基[11]．

EcoRⅠ限制性内切酶、NotⅠ限制性内切酶、DNA Marker、低相对分子质量蛋白Marker，大连宝生物公司；T4,DNA连接酶，Promega公司；Taq PCR Master Mix，博迈德公司；酵母提取物、蛋白胨，Oxiod公司；胶回收试剂盒，北京天恩泽基因公司；其他化学试剂均购自天津市北方天医化学试剂厂．

1.3 胆固醇7，8–脱氢酶基因的获取

通过查阅文献及NCBI中比对，获得nvd-Bm基因全序列(GenBank登录号：AB232986.1)；并利用Vector NTI suite 7.0等分子生物学软件，在不改变其蛋白质氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子使用频率、GC含量的调整、不稳定序列的删除、mRNA二级结构等影响因素，按照巴斯德毕赤酵母的偏爱性对该序列进行密码子改造优化[12]．并于目标基因nvd-Bm两侧引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点后，委托金唯智公司进行全基因合成．

1.4 毕赤酵母重组表达菌株的构建

用EcoRⅠ和NotⅠ将由公司合成并连有目标基因的重组克隆载体pUC57-nvd-Bm及毕赤酵母表达载体pPIC9K进行双酶切，回收1.3,kbp的片段及pPIC9K骨架，回收产物用T4 DNA连接酶进行连接转化大肠杆菌DH5α，筛选得到重组表达载体pPIC9K-nvd-Bm，对重组表达载体进行PCR鉴定及双酶切鉴定，并将鉴定正确的转化子进行测序验证．

将筛选得到的重组表达载体pPIC9K-nvd-Bm经BglⅡ线性化，电转入毕赤酵母GS115感受态细胞中，电击条件：1.5,kV、25,µF、200,Ω．转化菌液分别涂布于含4,g/L G418的YPD平板上，30,℃孵育至抗性克隆出现．

挑取抗性克隆，通过玻璃珠和酚氯仿抽提酵母基因组，以基因组为模板，利用5’AOX1/3’AOX1引物进行PCR筛选成功整合的阳性克隆，挑取阳性克隆菌株于YPD培养基中，30,℃培养20,h后，保存甘油管．

1.5 重组质粒在毕赤酵母中的诱导表达及SDSPAGE分析

将筛选出的阳性克隆接种于100,mL BMGY中，30,℃、250,r/min生长至A600≈3，离心收集菌体，转接于BMMY培养基中30,℃培养，以最终质量分数为0.5%的甲醇溶液进行诱导表达．5,d后离心经甲醇诱导后的培养液上清液转移至干净的收集管中，沉淀用裂解缓冲液重悬后通过酸洗玻璃珠涡旋振荡法进行细胞破碎．分别取菌体培养液上清液及细胞破碎上清液，通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况．

2 结果与分析

2.1 胆固醇脱氢酶基因nvd-Bm的获取及分析

来源于家蚕的胆固醇7，8–脱氢酶基因nvd-Bm(GenBank登录号：AB232986.1)全长为1,362,bp，GC含量为53.3%．依据表达宿主毕赤酵母的密码子偏爱性，进行该基因的密码子优化，改变了其中的335个碱基对，其GC含量由53.3%降低到52.9%，优化后的基因序列见图1．

NotⅠ和EcoRⅠ双酶切的质粒pUC57-nvd-Bm及pPIC9K的电泳图如图2所示．从图2可以看出：泳道1的1.3,kbp片段、泳道2的9.3,kbp片段，分别与目标基因nvd-Bm及pPIC9K预期结果相符合，表明已成功获得目标基因片段．

2.2 表达载体的构建

重组质粒pPIC9K-nvd-Bm的PCR验证电泳图如图3所示．由图3可以看出：图中的1.8,kbp片段，与pPIC9K-nvd-Bm菌液PCR预期结果相符合，表明目标基因nvd-Bm已成功插入毕赤酵母表达质粒pPIC9K中．取图3中的pPIC9K-nvd-Bm重组质粒进行双酶切验证，结果如图4所示．图4中均出现了1.3,kbp片段，进一步表明目标基因nvd-Bm已成功插入毕赤酵母表达质粒pPIC9K中．选取图4中验证正确的菌株交由公司进行测序，测序结果与目标基因完全一致，表明重组表达载体pPIC9K-nvd-Bm构建成功．

2.3 转化毕赤酵母重组子的筛选和鉴定

含有pPIC9K-nvd-Bm的毕赤酵母工程菌进行基因组PCR验证，结果如图5所示．图5出现的1.8,kbp片段，与重组毕赤酵母GS115基因组PCR预期结果相符，表明目标基因nvd-Bm均已成功整合至毕赤酵母GS115基因组中．

2.4 胆固醇7, 8–脱氢酶的表达

已构建的含有pPIC9K-nvd-Bm的毕赤酵母工程菌经甲醇诱导后，分别收集菌体培养液上清液及沉淀．沉淀经细胞破碎后，将菌体培养液上清液及细胞破碎上清分别经蛋白电泳上样缓冲液重悬煮沸进行SDS-PAGE分析．结果如图6所示．

由图6可知：第2泳道，即含有pPIC9K-nvd-Bm的毕赤酵母工程菌培养液在相对分子质量约为6.4× 104的位置存在明显的特异性条带，由于转录翻译起始于载体自身的起始密码子，翻译时会同时将载体上的起始密码子至目标基因的起始密码子间的一段序列一并翻译出，而该段氨基酸序列相对分子质量约为1.3×104，故表达的蛋白相对分子质量会比实际蛋白相对分子质量5.1×104偏大，约为6.4×104，与预期相对分子质量一致；另外，由于在毕赤酵母中表达的蛋白会受到不同程度的糖基化作用，因而电泳中观测到的蛋白相对分子质量会比目标蛋白出现不同程度的偏大．进一步经蛋白质谱鉴定，证明其蛋白一级序列与目标蛋白相符，表明目标蛋白得到表达，表达量较高．

3 讨 论

化学法合成7–脱氢胆固醇的生产工艺一般需要4步合成反应，转化率为62%左右，反应途径长、副产物多、反应条件不易控制[13]．生物转化法具体高效、绿色的特性，使其成为许多化学药物和医药中间体化学合成工艺的替代技术[14]．

目前虽已有关于基因nvd-Dm在大肠杆菌中表达的相关报道，但由于其未依据大肠杆菌的偏爱性进行密码子优化，故表达效率偏低．另外，由于目标基因来自于昆虫细胞，其转录翻译更适合在真核表达体系中进行．本研究对获得的胆固醇7，8–脱氢酶基因nvd-Bm(GenBank登录号：AB232986.1)于毕赤酵母中进行了外源表达，并依据毕赤酵母偏爱性进行了密码子优化，优化后的基因与黄时海等[11]于大肠杆菌中进行的外源表达相比，有效地提高了胆固醇7，8–脱氢酶Nvd-Bm的表达效率．本研究还构建了重组质粒pPIC9K-nvd-Bm，并通过电转化方法，构建了含有pPIC9K-nvd-Bm的毕赤酵母GS115工程菌，SDSPAGE蛋白电泳分析表明，目标蛋白Nvd-Bm均已成功表达，但均主要存在于胞内．下一步工作可通过改造pPIC9K-nvd-Bm重组质粒信号肽序列引导目标蛋白高效胞外分泌，进一步提高其分泌表达量．此外，7，8–脱氢酶的基因组成目前尚不清晰，仅获得其编码基因表达蛋白，往往难以表现出酶活性．因此本课题组将进一步研究其与伴侣蛋白的共表达，为胆固醇7，8–脱氢酶的活性检测奠定基础．

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责任编辑：周建军

Expression of the Protein Related to Cholesterol 7，8-Dehydrogenation

TANG Rui，SHEN Yanbing，GE Rile，NIU Dandan，WANG Min
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Bombyx moriNvd-Bm protein is associated with cholesterol 7，8-dehydrogenase. Based on DNA sequence encoded cholesterol 7，8-dehydrogenase reported on the NCBI(GenBank：AB232986.1)，cholesterol 7，8-dehydrogenase gene was cloned fromBombyx mori. Through codon optimization，cholesterol 7，8-dehydrogenase gene was obtained and the optimized gene was cloned into a yeast expression vector. Heterologously expressed target gene inP. pastorisGS115 resulted in the creation of engineeredP. pastorisGS115 / pPIC9K-nvd-Bm strains. Expression of the target protein in the engineeredP. pastorisGS115 / pPIC9K-nvd-Bm strains was demonstrated by SDS-PAGE. This study provided a foundation for the biological synthesis of 7-dehydrocholesterol.

Bombyx mori；cholesterol 7，8-dehydrogenase；codon optimization；Pichia pastoris；induced expression

Q812

A

1672-6510(2014)06-0027-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.06.006

2014–01–10；

2014–05–08

国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2011AA02A211)

汤 睿（1989—），女，河北人，硕士研究生；通信作者：王 敏，教授，minw@tust.edu.cn.