底物对凝结芽孢杆菌TQ33产苯乳酸的影响

王海宽，高雪芹，张淑丽，周超

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

底物对凝结芽孢杆菌TQ33产苯乳酸的影响

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

苯乳酸是一种具有广泛抑菌活性的化合物，它可以由许多微生物产生，尤其是乳酸菌．凝结芽孢杆菌TQ33是一株能够产生苯乳酸的微生物．将凝结芽孢杆菌TQ33在发酵液中培养72,h后，发酵上清液中苯乳酸的质量浓度达到了(51.7±1.0) mg/L．为了提高苯乳酸产量，将苯丙酮酸加入到发酵培养基中，结果证明凝结芽孢杆菌TQ33能够有效地将苯丙酮酸转化为苯乳酸，从而获得高浓度的苯乳酸，最高质量浓度为(726.1±3.0) mg/L．苯丙酮酸的添加使苯乳酸的产量提高了13倍，发酵时间由原来的72,h缩短到24,h．旋光性实验证明凝结芽孢杆菌TQ33产生的苯乳酸为L–苯乳酸．

凝结芽孢杆菌TQ33；苯乳酸；苯丙酮酸

苯乳酸在高温和低pH下具有很好的稳定性，它是一种旋光性化合物，具有两种手性结构：L–苯乳酸和D–苯乳酸．除了奶酪和蜂蜜以外[1-2]，在许多微生物的代谢产物中也能够找到苯乳酸．苯乳酸的安全性和抗细菌[3]、真菌活性，使苯乳酸作为防腐剂在食品和饲料中具有很大的应用潜能．

目前，有化学和生物合成这两条途径可以合成苯乳酸．研究[4]表明在苯丙氨酸生成苯乳酸的过程中，苯丙氨酸首先由转氨酶催化生成苯丙酮酸，进一步被脱氢酶催化生成苯乳酸．与化学合成相比，生物合成苯乳酸更安全、环保．近几年，微生物尤其是乳酸菌合成苯乳酸引起人们的广泛关注．有研究表明，多数的乳酸菌例如植物乳杆菌、希氏乳杆菌、柠檬明串珠菌都可以利用MRS培养基发酵获得苯乳酸，这些乳酸菌产生的苯乳酸的产量在0.16～0.46,mmol/L[5].对许多乳酸菌来说，转氨反应对苯乳酸的合成是限速反应，因此目前苯丙酮酸被认为是合成苯乳酸最适合的底物[6]．另外，戊糖片球菌[7]、白地霉[8]也能有效地

将苯丙氨酸和苯丙酮酸转化为D–苯乳酸．丙酸菌[9]也可以产生0.01～0.1,mmol/L的苯乳酸．

凝结芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，可以在广泛的温度和pH环境中生长[10]．另外，凝结芽孢杆菌还可以在胃液、胆汁中存活，并且能够黏附在人肠壁上皮细胞上，有利于调节肠道菌群和免疫应答[11]．由于易于培养和保存，凝结芽孢杆菌作为益生菌有很大的优势．但是，凝结芽孢杆菌产苯乳酸的研究[12]比较少.本文比较了凝结芽孢杆菌TQ33与其他3株凝结芽孢杆菌产苯乳酸的产量，研究凝结芽孢杆菌TQ33产苯乳酸的能力，并且通过底物的添加来提高凝结芽孢杆菌TQ33产苯乳酸的能力．另外，通过分离收集发酵液中的苯乳酸，利用全自动旋光仪确定了凝结芽孢杆菌TQ33产生的苯乳酸的旋光性．

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

凝结芽孢杆菌TQ33，取自天津科技大学酶与应用微生物实验室．凝结芽孢杆菌1.949、1.2407和1.2009购买于中国微生物菌种保存中心．

苯乳酸、苯丙酮酸、苯丙氨酸，分析纯，Sigma公司；乙腈，色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司；其他试剂材料为市售．

1.2 培养基与培养条件

1.2.1 培养基

斜面培养基(g/L)：蛋白胨10.0、酵母膏3.0、葡萄糖5.0、琼脂20.0，pH 7.2～7.4．

种子培养基(g/L)：蛋白胨20.0、酵母膏10.0、葡萄糖20.0，初始pH 7.2～7.4．

发酵培养基(g/L)：蛋白胨10.0、酵母膏10.0、葡萄糖6.0、硫酸镁1.0、磷酸氢二钾2.0，初始pH 7.2～7.4．

1.2.2 培养条件

种子培养条件：取斜面种子，用接种环挑取两环菌苔接入装有50,mL种子培养基的250,mL三角瓶中，37,℃、180,r/min振荡培养18,h．

发酵条件：按照体积比以5%的接种量将种子液接入装有100,mL发酵培养基的500,mL三角瓶中．每个样品3个平行，37,℃、180,r/min培养一定时间．

1.3 发酵液中苯乳酸、苯丙酮酸和苯丙氨酸的检测方法

取发酵一定时间后的发酵液2,mL于离心管中，10,000,r/min离心5,min，吸取上清液，过膜(0.22,µm).滤液进行高效液相色谱分析，3种成分的色谱分析条件如下．

苯乳酸检测的液相条件：Agilent Zorbax SB-C18色谱柱，流动相为体积比90∶10的1,mmol/L H2SO4与乙腈的混合液，进样量为10,µL，流量为0.7,mL/ min，柱温为30,℃，检测波长210,nm．

苯丙酮酸检测的液相条件：Agilent Zorbax SBC18色谱柱，流动相为体积比93∶7的1,mmol/L H2SO4与乙腈的混合液，进样量为10,µL，流量为0.4,mL/min，柱温为30,℃，检测波长210,nm．

苯丙氨酸检测的液相条件：Agilent Zorbax SBC18色谱柱，流动相为体积比95∶5的1,mmol/L H2SO4与乙腈的混合液，进样量为10,µL，流量为0.2,mL/min，柱温为30,℃，检测波长210,nm．

1.4 实验方法

1.4.1 不同凝结芽孢杆菌的苯乳酸产量测定

分别挑取凝结芽孢杆菌TQ33和其他3株凝结芽孢杆菌，接入种子培养基中；37,℃、180,r/min培养18,h；培养完成后将这4株菌的种子液以5%的接种量接入发酵培养基中,每株菌3个平行，37,℃、180,r/min培养；72,h后离心发酵液，检测不同菌株苯乳酸产量．

1.4.2 凝结芽孢杆菌TQ33生长曲线及不同发酵时间苯乳酸产量测定

采用分光光度计分别检测凝结芽孢杆菌TQ33培养0、2、4、6、12、24、48、72、96,h时样品的A600，高效液相色谱法检测相应时间苯乳酸的产量．

1.4.3 苯丙氨酸添加量对凝结芽孢杆菌TQ33合成苯乳酸的影响

控制发酵培养基中苯丙氨酸的添加量为0.2、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0,g/L，灭菌后接入凝结芽孢杆菌TQ33发酵72,h后，取样检测苯乳酸的产量．

1.4.4 苯丙氨酸对发酵过程中苯乳酸和苯丙酮酸生成的影响

添加苯丙氨酸(添加量0.5,g/L)的发酵培养基经过灭菌后接入凝结芽孢杆菌TQ33，37,℃、180,r/min培养．分别在0、2、4、6、12、24、48、72,h取样，检测相应时间发酵液中的苯乳酸、苯丙酮酸和苯丙氨酸含量．

1.4.5 苯丙酮酸添加量对凝结芽孢杆菌TQ33合成苯乳酸的影响

控制发酵培养基中苯丙酮酸的添加量分别为

0.5、1.0、2.0、3.0,g/L，发酵72,h检测苯乳酸的含量．

1.4.6 苯丙酮酸对发酵过程中苯乳酸合成的影响

控制发酵液中苯丙酮酸的添加量为2.0,g/L，凝结芽孢杆菌TQ33发酵液培养过程中，分别在0、2、4、6、12、24、48、72,h取样，检测对应时间的发酵液中苯乳酸和苯丙酮酸含量．

1.4.7 凝结芽孢杆菌TQ33产生的苯乳酸旋光性的确定

通过制备液相色谱分离纯化发酵液中的苯乳酸．实验使用的是安捷伦1200液相色谱系统，色谱柱为PrepHI×300,SB-C18(21.2,mm×150,m)，流量10,mL/min．苯乳酸收集完后，利用WZZ–3型全自动旋光仪检测苯乳酸的旋光性，蒸馏水作为对照，实验重复3次．若旋光度是正值，则为D–苯乳酸，否则为L–苯乳酸[13]．

2 结果与讨论

2.1 不同凝结芽孢杆菌合成苯乳酸的比较

不同凝结芽孢杆菌的苯乳酸产量如图1所示．由图1可以看出：凝结芽孢杆菌TQ33苯乳酸的产量最高，为(49.5±1.0)mg/L；其次为凝结芽孢杆菌1.2009，产量为(37.6±1.2)mg/L．不同菌株的苯乳酸产量相差较大，可能是不同菌株中与苯乳酸合成相关的酶活性不同，在该研究所采取的实验条件下，凝结芽孢杆菌TQ33合成苯乳酸的酶活性可能最高．

2.2 凝结芽孢杆菌TQ33生长曲线以及不同发酵时间苯乳酸的产量

凝结芽孢杆菌TQ33生长曲线以及不同发酵时间苯乳酸的产量如图2所示．由图2可以看出：0～6,h内，A600变化很小，说明在这段时间内，发酵液中凝结芽孢杆菌TQ33菌体浓度变化很小，为延迟期；6～72,h内，凝结芽孢杆菌TQ33菌体浓度不断增加，在72,h时达到最大值，这段时间为发酵的对数期；再延长培养时间，A600基本不变，说明72,h后菌体浓度基本不变，为稳定期．而苯乳酸的产量在发酵2,h内就开始不断增加，一直到72,h达到最高产量，继续延长发酵时间，苯乳酸产量下降．

2.3 苯丙氨酸添加量对苯乳酸合成的影响

苯丙氨酸对凝结芽孢杆菌TQ33苯乳酸产量的影响如图3所示．

由图3可以看出：随着苯丙氨酸添加量的提高，苯乳酸的产量升高，苯丙氨酸的转化率增加；但是苯丙氨酸的添加量超过0.5,g/L时，苯乳酸产量和苯丙氨酸的转化率都降低，这可能是高浓度的苯丙氨酸会抑制转氨酶的活性，从而使苯乳酸产量降低．

2.4 苯丙氨酸对发酵过程中苯乳酸和苯丙酮酸生成的影响

添加0.5,g/L苯丙氨酸时，苯乳酸和苯丙酮酸生成量的变化如图4所示．由图4可以看出：发酵培养基中加入0.5,g/L苯丙氨酸时，苯乳酸的产量不断增

加，48,h以后产量变化逐渐减小．在整个发酵过程中，一直未检测到苯丙酮酸，这应该是苯丙氨酸转化为苯丙酮酸后，很快被进一步转化生成了苯乳酸，这也说明了转氨反应是整个反应的关键步骤[6]．

2.5 苯丙酮酸添加量对苯乳酸产量的影响

苯丙酮酸添加量对苯乳酸产量的影响如图5所示．由图5可以看出：添加了苯丙酮酸以后，苯乳酸产量明显增大，并且随着苯丙酮酸添加量的增加，苯乳酸产量也增加，在添加量为2,g/L时，苯乳酸的产量达到最大值，此时苯丙酮酸的转化率最大为92.1%；苯丙酮酸的添加量继续增加时，苯乳酸产量和苯丙酮酸转化率都下降，这可能是高浓度的苯丙酮酸抑制了转化过程中的酶，从而使苯乳酸产量下降．

2.6 苯丙酮酸对发酵过程中苯乳酸合成的影响

添加2.0,g/L的苯丙酮酸，发酵过程中苯乳酸和苯丙酮酸浓度的变化如图6所示．由图6可以看出：苯丙酮酸的含量逐渐减少，苯乳酸的产量不断增加，24,h时苯乳酸产量达到最大值；此后苯乳酸产量变化不大，并且苯丙酮酸减少量变化也很小，这说明24,h以后，苯丙酮酸就不再转化为苯乳酸，因此培养基中加入了苯丙酮酸后可以将苯乳酸的取样时间缩短到24,h．

2.7 凝结芽孢杆菌TQ33产生的苯乳酸旋光性的确定

经检测，凝结芽孢杆菌TQ33产生的苯乳酸旋光度为－0.52，说明凝结芽孢杆菌TQ33所产生的苯乳酸为L–苯乳酸．这与所报道的其他菌株不同，乳酸菌和丙酸菌所产生的是D–苯乳酸和L–苯乳酸的混合体，只是这两种构象的苯乳酸比例不同[14]．另外，关于D–苯乳酸和L–苯乳酸的抗菌活性有不同的报道，D–苯乳酸比L–苯乳酸显示出了更高的抗李斯特菌的活性[8]．

3 结 论

通过4株凝结芽孢杆菌苯乳酸产量的比较发现，凝结芽孢杆菌TQ33苯乳酸产量最高，说明凝结芽孢杆菌TQ33产苯乳酸能力最强．苯丙氨酸添加量为0.5,g/L时，苯乳酸产量提高到(89.9±0.7),mg/L，而添加苯丙酮酸为2,g/L时，苯乳酸的产量由原来的(51.7±1.0),mg/L，提高到(726.1±3.0),mg/L，产量提高了13倍．不同底物添加量以及苯乳酸产量的差别也表明了在苯丙氨酸生成苯乳酸的过程中，转氨反应为限速步骤．在发酵培养基中加入苯丙氨酸，苯乳酸最佳转化时间可以缩短到48,h；而加入苯丙酮酸时，苯乳酸最佳获取的时间提前到24,h，这说明底物的添加可以缩短发酵时间．苯乳酸旋光性实验表明凝结芽孢杆菌TQ33产生的苯乳酸是L–苯乳酸．

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责任编辑：周建军

Effect of Substrates on the Production of Phenyllactic Acid of Bacillus coagulans TQ33

WANG Haikuan，GAO Xueqin，ZHANG Shuli，ZHOU Yanchao
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Phenyllactic acid (PLA), produced by many microorganisms especially lactic acid bacteria (LAB), is an antimicrobial compound with a broad antimicrobial spectrum. Bacillus coagulansTQ33,isolated from skimmed milk powder can produce PLA. The concentration of PLA reached (51.7±1.0) mg/L in cell-free supernatant after 72,h incubation in fermentation liquor. Moreover, when phenylpyruvic acid (PPA) was added into medium,B. coagulansTQ33,could effectively convert PPA into PLA with a high PLA producing concentration of (726.1 ± 3.0) mg/L. The production increased 13-fold and the fermentation time decreased from 72,h to 24,h. The structure of PLA produced byB. coagulansTQ33,was proved to be L-PLA.

Bacillus coagulansTQ33；phenyllactic acid；phenylpyruvic acid

Q93

A

1672-6510(2014)06-0011-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.06.003

2013–12–18；

2014–04–26

国家自然科学基金资助项目(20876116，30900961)；乳品生物技术与工程教育部重点实验室开放课题基金资助项目

王海宽（1974—），男，内蒙古人，教授，hkwang@aliyun.com.