过表达maspin对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

李艳琦，张同存，孙雪光，廖兴华，王 楠，罗学刚

(天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

过表达maspin对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

李艳琦，张同存，孙雪光，廖兴华，王 楠，罗学刚

(天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

通过构建maspin表达质粒，在人乳腺癌MCF-7细胞中过表达maspin，研究maspin对MCF-7细胞增殖率及凋亡率的影响．MTT检测实验表明，过表达maspin能够剂量依赖性抑制MCF-7细胞的增殖率．采用TUNEL法和流式细胞术检测maspin对MCF-7细胞凋亡的影响，结果表明过表达maspin可促进MCF-7细胞凋亡进而抑制其增殖．

乳腺癌；MCF-7细胞；maspin；凋亡

乳腺癌是具有高发率和死亡率的恶性肿瘤之一[1]．乳腺癌的发生和发展是多基因突变的结果，这包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活[2]．maspin是一种新型的非经典丝氨酸蛋白酶抑制剂，作为一个肿瘤抑制基因，它能在体内抑制肿瘤的生长和迁移[3–4]．maspin已经被证明能够抑制细胞运动性、侵袭和迁移[5–6]．然而，maspin对细胞增殖和凋亡的影响还没有被研究清楚．本文构建了maspin的表达质粒，探索过表达maspin对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响，这将为maspin在乳腺癌治疗方面的应用提供理论基础．

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM低糖培养基，Gibico公司；胎牛血清，天津康源生物技术有限公司；空载质粒pcDNA3.1，本实验室保藏；Fast Pfu DNA聚合酶、质粒抽提试剂盒，北京全式金生物技术有限公司；KpnⅠ限制性内切酶、XhoⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DeadEndTM荧光测定TUNEL系统，Promega生物技术有限公司；M-MLV逆转录酶、Turbo转染试剂、Trizol裂解液，上海英骏生物技术有限公司；胶回收试剂盒、DM2000 Plus DNA Marker，北京康为世纪生物科技有限公司；maspin一抗，Abcam公司；MTT，北京索莱宝科技有限公司；Annexin V细胞凋亡检测试剂盒，天津三箭生物技术有限公司．

1.2 细胞株和细胞培养

人乳腺癌细胞株MCF-7细胞为本实验室保藏．在含体积分数10%灭活胎牛血清的DMEM低糖

培养液中，于37,℃、CO2体积分数5%条件下培养．用体积分数0.25%的胰酶进行消化传代．

1.3 质粒构建

收集培养的人乳腺癌细胞株MCF-7细胞，提取总RNA后按M-MLV逆转录酶说明书逆转录成cDNA．以此cDNA为模板，以NCBI上提供的maspin mRNA序列(NM_002639.4)设计包含maspin基因全长和Kpn/ⅠXhoⅠ双酶位点的引物，上游引物5′-CAGGGGTACCATGGATGCCCT-3′，下游引物5′-GCCACTCGAGTTAAGGAGAACAGAATT-3′，PCR扩增出产物长度为1,148,bp的maspin基因．

将目的基因正向插入到pcDNA3.1载体的KpnⅠ和XhoⅠ克隆位点，构建表达质粒maspin/pcDNA3.1，并经内切酶和测序证实．

1.4 质粒转染和RT-PCR检测maspin mRNA水平的表达

用TurbofectTM细胞转染试剂将4,μg表达质粒maspin/pcDNA3.1按质粒与转染试剂(μg∶μL)1∶2的比例转染到MCF-7细胞中．对照组为未处理组和转染空白质粒组．将细胞以2×105个/孔接种于6孔板中培养12,h后，将质粒–脂质体复合物转染至细胞中，在无血清的培养液中培养6,h后换新鲜含血清培养液，继续培养18,h．而后分别收集正常培养、转染空质粒和转染表达质粒细胞，提取总RNA后逆转录成cDNA．以此为模板进行PCR反应．maspin上游引物5′-AGTGGGTGCTAAAGGTGA-3′，下游引物5′-GAGCCGCTTGATTAGTTT-3′，扩增产物大小148,bp．内参GAPDH由英骏生物技术有限公司合成，上游引物5′-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物5′-GCAGAAGGGGCGGAGATGA-3′，产物大小213,bp，扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色．用BioRad图像分析仪成像并进行半定量分析，以测定目的基因的表达水平．

1.5 Western blot检测maspin蛋白水平的表达

分别收集正常培养、转染空质粒和表达质粒48,h后细胞提取总蛋白，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样本．将蛋白样本转移至NC膜上．牛奶封闭液37,℃封闭NC膜1,h，maspin一抗(兔抗，1∶1,000)4,℃孵育过夜．弃一抗，用PBS洗膜3次，加入红外(700或800,nm)荧光染料标记的二抗(山羊抗兔，1∶5,000)，避光平稳摇动，室温1.5,h．弃二抗，用PBS洗膜3次，利用oddysey远红外成像系统(LICOR公司)扫膜．

1.6 MTT法检测细胞增殖率

取对数生长期的MCF-7细胞，调整浓度为104,mL-1，接种于96孔培养板中，每孔100,μL．培养12,h后弃去培养基，对照组转染pcDNA3.1，实验组梯度转染maspin/pcDNA3.1(0.05、0.15、0.20,μg)，每组设5个平行孔．在无血清的培养液中培养6,h后换新鲜含血清培养液，继续培养18,h．用PBS洗2次，每孔加入质量浓度为5,mg/mL的MTT 20,μL和无血清培养液80,μL．继续培养4,h后弃去上清液，每孔加入DMSO 100,μL，振荡使紫色结晶物充分溶解.在酶标仪上测定波长490,nm处各孔的吸光度A，并按式(1)计算细胞增殖率．

1.7 TUNEL法检测细胞凋亡情况

取MCF-7细胞接种于24孔培养板中，培养12,h后分别转染pcDNA3.1、maspin/pcDNA3.1，质粒质量为1,μg，质粒与转染试剂比例(μg∶μL)为1∶2，24,h后吸去培养基，用PBS洗涤3次．加入4%多聚甲醛溶液，4,℃放置25,min．加入PBS，放置5,min，重复2次．加入体积分数0.25%的Triton X-100溶液，放置20,min．加入PBS，室温放置5,min，重复2次．吸干孔板中液体，用100,μL平衡缓冲液覆盖细胞，室温放置10,min．吸掉大部分平衡缓冲液，加入50,μL rTdT孵育缓冲液，37,℃避光放置1,h．将300,μL 2×SSC加入孔板，室温放置15,min．加入PBS，放置5,min，重复2次．加入300,μL DAPI溶液，室温放置15,min．加入PBS，室温放置5,min，重复2次．立即在共聚焦显微镜(OLYMPUSG公司)下观察细胞的凋亡情况．

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡情况

分别转染pcDNA3.1、maspin/pcDNA3.1，质粒质量为8,μg，质粒与转染试剂比例(μg∶μL)为1∶2，而后分别收集正常细胞，转染pcDNA3.1的细胞、转染maspin/pcDNA3.1的细胞，800,g离心10,min，弃上清液．冰PBS洗细胞1次．用1,mL Binding Buffer悬浮细胞，300,g离心10,min，弃上清液．用1,mL Binding Buffer重悬细胞，调整细胞浓度为1×106mL-1，取100,μL细胞悬液加入5,μL Annexin VFITC，轻轻振荡混匀，室温避光孵育10,min，再加入5,μL PI，室温避光孵育5,min，补加400,μL Binding Buffer，轻轻振荡混匀，1,h内进行流式细胞定量分析，检测细胞凋亡情况．

2 结果与分析

2.1 maspin/pcDNA3.1表达质粒的鉴定

以提取的cDNA为模板克隆maspin基因片段，将纯化后的PCR产物双酶切后连接到表达载体pcDNA3.1上，构建出表达质粒maspin/pcDNA3.1(图1)．表达质粒maspin/pcDNA3.1经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后得到载体片段和maspin基因片段，初步证明maspin基因被插入到空载质粒中(图2)．测序鉴定结果表明maspin已成功连接到载体pcDNA3.1上，无突变，与NCBI相应序列一致．

2.2 maspin/pcDNA3.1转染MCF-7细胞后maspin mRNA表达变化

为了检测转染后maspin是否得到了表达，采用了半定量RT-PCR检测maspin mRNA表达情况，结果如图3所示．由图3可知：未转染组和转染空载质粒组maspin mRNA无表达；而maspin/pcDNA3.1转染组与前二者比较maspin mRNA表达明显增强．这说明转染maspin/pcDNA3.1表达质粒后maspin能在mRNA水平进行过表达，且转入空载质粒不影响maspin在mRNA水平的表达．

2.3 maspin/pcDNA3.1转染MCF-7细胞后maspin蛋白表达变化

为了检测转染后maspin是否得到了表达，采用了半定量RT-PCR检测maspin蛋白表达情况，结果如图4所示．由图4可知：未转染组和转染空载质粒组maspin蛋白无表达；而maspin/pcDNA3.1转染组与前二者比较maspin蛋白表达明显增强．这说明转染maspin/pcDNA3.1表达质粒后maspin能在蛋白水平进行过表达，且转入空载质粒不影响maspin在蛋白水平的表达．

2.4 转染maspin对MCF-7细胞增殖的影响

利用MTT法检测转染空载质粒pcDNA3.1和梯度转染maspin/pcDNA3.1表达质粒后MCF-7细胞的增殖能力，结果见表1．由表1可知：细胞表达maspin蛋白后增殖能力明显降低，且抑制效应呈现剂量依赖性变化．提示过表达maspin能抑制MCF-7细胞的增殖．

2.5 TUNEL检测转染maspin后MCF-7细胞的凋亡

MCF-7细胞分别经空载质粒pcDNA3.1和表达质粒maspin/pcDNA3.1转染24,h后，利用TUNEL观察细胞凋亡率的改变．随机选取10个视野进行观察并经统计软件计算凋亡率．TUNEL检测细胞凋亡

情况如图5所示．由图5可知DAPI所染的为细胞核，右侧染料所染为凋亡细胞．与转染空载质粒组相比，转染表达质粒组细胞凋亡数量升高了约9倍．

2.6 流式细胞术检测转染maspin后MCF-7细胞的凋亡

应用AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡，横坐标是Annexin-V FITC，纵坐标是PI，正常活细胞分布在流式细胞分析图的左下区，早期凋亡细胞分布在流式细胞分析图的右下区，晚期凋亡或坏死细胞分布在流式细胞分析图的右上区，坏死细胞分布在流式细胞分析图的左上区，图6结果显示转染重组质粒组与转染空载质粒组MCF-7细胞早期凋亡、晚期凋亡或坏死率均明显增加．

3 讨 论

maspin作为丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的一个非抑制剂成员，在多种癌症类型中发挥抑癌作用[7]. maspin的抗肿瘤影响是抑制肿瘤细胞的侵袭，增强对细胞外基质的粘附，增强对凋亡的敏感性，抑制新生血管的形成[5–6]．然而，关于maspin在影响MCF-7细胞的增殖与凋亡的研究目前比较少．

maspin能够在正常的乳腺或前列腺上皮细胞中表达，然而其在肿瘤细胞中表达减少或丧失[8]．maspin基因在乳腺癌细胞中的表达缺失不是因为maspin基因的缺失或重排[9]，这表明在乳腺癌发展过程中可能有转录水平的因素来调节maspin的表达．

凋亡是一种主要的细胞自我消亡过程，它被认为是一种阻止乳腺癌细胞发展的有效途径．作为抗肿瘤药物的凋亡诱导物已经引起了广泛关注，其中的一些已经被应用于临床[10]．它可能是肿瘤治疗中一种非常有前景的治疗途径．先前的报道[6]已经证明maspin在功能上可能与乳腺癌细胞的凋亡有关，能够使乳腺癌细胞对十字孢碱引起的细胞凋亡更为敏感．而且，5–杂氮脱氧胞苷(5-aza-dc)和曲古柳菌素(TSA)能引起细胞凋亡，并且在这个过程中伴随的maspin的重新表达也可能与凋亡有关[11]．maspin作为一种新型的E2F1调节基因，表明它可能参与E2F1引起的细胞凋亡，尤其是E2F1和化学药剂共同引起的凋亡[12]．先前的一些报道[5]还阐明maspin能引起Bax和P21的表达来调节乳腺癌细胞的凋亡．本文也证明了过表达maspin能够诱导MCF-7细胞的凋亡，从而可以剂量依赖性地抑制MCF-7细胞的增殖．以上结果提示maspin对肿瘤的调节方式是多样化的，并可能与肿瘤的类别有密切关系．

本实验研究表明maspin能抑制MCF-7细胞的增殖并引起其凋亡，所以maspin可能在乳腺癌细胞凋亡中起重要作用，并有希望成为一种以凋亡为基础的乳腺癌治疗的改良药剂，但其具体机制还应进一步研究．

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责任编辑：周建军

Effect of Overexpressing Maspin on the Apoptosis of Human Breast Cancer Cell MCF-7

LI Yanqi，ZHANG Tongcun，SUN Xueguang，LIAO Xinghua，WANG Nan，LUO Xuegang
(College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

By constructing maspin expression plasmid，the effects of overexpressed maspin on the proliferation and apoptosis of human breast cancer cell MCF-7 were studied. The proliferation of MCF-7 cells was observed with MTT. The results show that the overexpression of maspin inhibited MCF-7 cell’s proliferation in a dose dependent manner. The apoptosis of MCF-7 cells was observed with TUNEL and flow cytometry. The results indicate that the maspin overexprssion could promote the apoptosis of MCF-7 cell and thereby inhibit cellular proliferation.

breast cancer；MCF-7 cells；maspin；apoptosis

R737.9

A

1672-6510(2014)05-0020-04

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.05.005

2013–12–05；

2014–03–12

国家自然科学基金资助项目(31071126，31000343)

李艳琦（1989—），男，天津人，硕士研究生；通信作者：张同存，教授，tony@tust.edu.cn.