运用绿色荧光蛋白探讨肉葡萄球菌双精氨酸分泌途径

高 强，许保银，程逸冰，王 林，张朝正，田萍萍

(1. 工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2. 天津科技大学计算机科学与信息工程学院，天津 300222)

运用绿色荧光蛋白探讨肉葡萄球菌双精氨酸分泌途径

高 强1，许保银1，程逸冰1，王 林2，张朝正1，田萍萍1

(1. 工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2. 天津科技大学计算机科学与信息工程学院，天津 300222)

根据肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)TM300的基因组序列设计引物，经PCR扩增得到其tufA基因的启动子Peftu片段与大肠杆菌–葡萄球菌穿梭载体pBT2-Tat-GFP连接，构建了穿梭质粒pBT2-ETG．结果表明，穿梭质粒pBT2-ETG成功地转入大肠杆菌与肉葡萄球菌宿主中稳定表达具有活性的绿色荧光蛋白GFP，并被转运到肉葡萄球菌宿主的细胞壁，为进一步研究肉葡萄球菌双精氨酸(Tat)转运系统正确分泌其他外源蛋白奠定了实验基础．

肉葡萄球菌；绿色荧光蛋白(GFP)；双精氨酸转运途径；启动子Peftu；Tat信号肽

作为肉制品发酵行业中形成肉制品风味的关键菌种，肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)在欧洲等地被用作发酵肉产品起始培养物已经超过60年[1].与其他葡萄球菌相比，它不产生任何毒素、溶血素、凝固酶或聚集因子，是葡萄球菌属中被完全确认的食品级GRAS(generally regarded as safe)菌株[2]．肉葡萄球菌具有很低的胞外蛋白水解能力，所以该菌可以作为基因克隆宿主菌[3]用于分子遗传学方面进行葡萄球菌属相关代谢途径的研究，以及安全正常地表达和分泌异源蛋白．

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，1962年由Shimomura等[4]在多管水母中首次发现．GFP受到紫外或蓝光激发时可发射出绿色荧光，发色团是自身分子内由3个氨基酸残基(甘氨酸、酪氨酸和苏氨酸)所组成的，其绿色荧光的产生无需底物或辅因子，并且持续时间较长[5]．

根据信号肽的结构，可将其分为分泌型(Sec)信号肽、双精氨酸转运(twin-arginine transolcation，Tat)信号肽和脂蛋白(Lip)信号肽等[6]．目前对Sec

系统的研究已相当完善，Sec转运系统只能转运未折叠或部分折叠的蛋白质[7]，而Tat转运系统可将处于正确折叠状态的蛋白质转运到细胞外，在基因工程领域中可以用于分泌无法通过Sec系统转运的外源蛋白[8]．GFP作为一种理想的报告蛋白，可以在S.,carnosus内表达[9]，但能否被正确地折叠和跨膜转运将取决于所选用的Tat信号肽序列[10–12]．

穿梭载体是能在2种不同的生物中复制的载体，通常用于克隆已扩增的基因[13]．目前，用于肉葡萄球菌宿主表达外源蛋白的质粒载体基本上都是非穿梭质粒，DNA连接产物直接转化肉葡萄球菌的效率低，转化较困难，而大肠杆菌–葡萄球菌的穿梭质粒，如pBT2载体[14]，就很好地解决了这个问题．因此，本实验以穿梭载体pBT2为骨架，通过导入强启动子，构建高效表达外源GFP的穿梭载体，探究双精氨酸分泌信号肽在肉葡萄球菌中对GFP的转运效果，从而为深入理解肉葡萄球菌中双精氨酸信号肽分泌机理及研究其他外源蛋白在肉葡萄球菌中的表达奠定实验基础．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α 由天津市工业微生物重点实验室保藏(保藏号TCCC 11800)；肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)TM300菌株由德国图宾根大学微生物遗传学研究所的Goetz教授[3]馈赠．pMD19-T Simple Vector购自宝生物工程(大连)有限公司；大肠杆菌−葡萄球菌穿梭质粒pBT2-Tat-GFP由本实验室以pBT2质粒为骨架构建得到，其中的Tat信号肽来源于肉葡萄球菌的铁依赖型过氧化物酶(FepB)[11]．

1.1.2 酶与试剂

Taq DNA聚合酶、1,kbp DNA Ladder和DNA MarkerⅢ购于天根生化科技(北京)有限公司；T4,DNA Ligase、限制性内切酶Kpn I、Bam HI和低分子质量蛋白质Marker购自Fermentas中国公司．PCR引物合成及DNA测序工作委托北京六合华大基因科技股份有限公司完成；质粒DNA的提取、DNA片段胶回收与产物纯化采用购自天津宝瑞生物技术有限公司的GeneBond系列试剂盒．其他试剂和药品为进口分析纯或生化级试剂．1.1.3 培养基和培养条件

大肠杆菌和肉葡萄球菌的培养均使用LB培养基(胰蛋白胨10,g/L，酵母浸提物5,g/L，NaCl 10,g/L，固体培养基含琼脂20,g/L)．对于重组菌株的筛选，氨苄青霉素终质量浓度为100,μg/mL，氯霉素终质量浓度为10,μg/mL．肉葡萄球菌感受态细胞的培养使用B2培养基(酪蛋白10,g/L，酵母浸提物25,g/L，葡萄糖5,g/L，NaCl 25,g/L，K2HPO41,g/L)．电转化孵育使用TSB培养基(胰蛋白胨17,g/L，大豆蛋白胨3,g/L，葡萄糖2.5,g/L，NaCl 5,g/L，K2HPO42.5,g/L)[15]．大肠杆菌和肉葡萄球菌的振荡培养条件均为37,℃、180,r/min.

1.2 方法

1.2.1 启动子Peftu的扩增

编码EF-Tu(延伸因子)的tuf基因广泛存在于原核生物中，其主要生物功能是在蛋白质合成过程中负责肽链的延伸，而且tuf基因的启动子属于强启动子，因此根据S.,carnosusTM300基因组中tufA基因(GenBank ID：7551602)的启动子Peftu序列，设计出1对引物eftu1和eftu2，用于扩增启动子Peftu片段. eftu1：5′-GGGTACC TTTTTTGGTAGGGTTCCT GAATT-3′(Kpn I)；eftu2：5′-CGGATCC TATGAAAT CTCTCCTCTTCTTAATAAAA AG-3′(Bam HI)

使用玻璃微珠法[16]提取的肉葡萄球菌基因组为模板，利用引物eftu1和eftu2以PCR法扩增启动子Peftu．扩增采用50,μL体系：ddH2O 17.5,μL，模板2.5,μL，eftu1 2.5,μL，eftu2 2.5,μL，2×Taq PCR MasterMix聚合酶25,μL．扩增程序为：95,℃ 10,min，94,℃,30,s，62.8,℃ 30,s，72,℃ 30,s，30个循环，72,℃10,min．琼脂糖凝胶电泳PCR产物，并对产物进行切胶回收．

1.2.2 pBT2-ETG载体的构建

启动子Peftu的PCR扩增产物与质粒pMD19-T Simple Vector通过T4 Ligase于16,℃过夜连接后，使用化学转化法转化进入E.,coli DH5α ，提取大肠杆菌转化子质粒，对其进行Kpn I/Bam HI双酶切验证及PCR验证．挑取携带有重组质粒的阳性转化子E.,coli DH5α 单菌落接种在含Amp的LB培养液中，37,℃、180,r/min过夜培养，培养物送至北京六合华大基因科技股份公司进行测序．

使用Kpn I/Bam HI对质粒pBT2-Tat-GFP进行双酶切，用DNA片段纯化回收试剂盒纯化回收相应的酶切产物，与测序正确并经相同双酶切的PCR产物通过T4,Ligase于16,℃进行过夜连接，连接产物使

用化学转化法转化进入E.,coli DH5α 宿主细胞中，提取大肠杆菌转化子质粒，对其进行Kpn I/Bam HI双酶切验证及PCR验证，并将该质粒命名为pBT2-ETG，其图谱见图1．

1.2.3 肉葡萄球菌的电转化

参照Gao等[17]改进的方法将连接产物电转化进入肉葡萄球菌，并对转化子质粒进行双酶切和PCR验证．

1.2.4 GFP的表达

分别接种阳性重组菌株S.,carnosusTM300/pBT2-ETG、S.,carnosusTM300/pBT2-Tat-GFP、E. coli/pBT2-ETG、E.,coli/pBT2-Tat-GFP，阴性对照菌株S.,carnosusTM300、E.,coli DH5α 于5,mL LB培养液中，37,℃、180,r/min过夜培养；转接0.5,mL过夜培养物于50,mL LB培养液中，37,℃、180,r/min继续培养16,h，以表达GFP．

1.2.5 表达产物GFP的检测

荧光显微镜观察：各取10,μL按1.2.4方法培养的菌液，滴在载玻片表面并盖好盖玻片后，置于荧光显微镜下观察各菌液的荧光产生情况．

SDS-PAGE与Native-PAGE分析：参考Meissner等[10]的方法，分别提取阳性重组菌株与阴性对照菌株的细胞壁和原生质体中蛋白组分，以发酵液为对照，使用5%的浓缩胶和12%的分离胶进行SDSPAGE与Native-PAGE检测．

2 结果与分析

2.1 启动子Peftu片段的PCR扩增

通过PCR反应扩增Peftu片段产物经琼脂糖凝胶电泳显示，在200,bp附近出现特异的单一DNA条带．将PCR产物与pMD19-T Simple Vector连接后进行测序，经过DNA序列比对，PCR产物与目的基因序列一致．PCR产物电泳分析结果见图2．

2.2 pBT2-ETG载体的构建

Kpn,I/Bam,HI双酶切在大肠杆菌中构建的pBT2-ETG载体，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳显示在200,bp与8,kbp附近分别出现DNA条带，与预计的目的片段大小一致，初步证明启动子Peftu已成功地克隆到pBT2-Tat-GFP载体中．酶切产物电泳分析结果见图3．

2.3 肉葡萄球菌的转化验证

肉葡萄球菌培养物经玻璃微珠破壁，使用GeneBond试剂盒提取pBT2-ETG质粒，Kpn I/Bam HI双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳显示，在200,bp和8,kbp附近出现DNA条带，与预计的目的基因片段大小一致，说明穿梭载体pBT2-ETG已成功转化入肉葡萄球菌宿主中．肉葡萄球菌重组质粒pBT2-ETG的Kpn,I和Bam HI双酶切验证分析结果见图4．

2.4 荧光显微镜观察

使用NIKON ECLIPSE TE2000–U型荧光显微镜观察转化子菌液，结果如图5所示．

由图5可以看出，构建成功的重组大肠杆菌和肉葡萄球菌宿主菌株均能发出荧光，说明pBT2-ETG载体编码的GFP能够表达并正确折叠，是具有活性的蛋白质．

2.5 SDS-PAGE分析

经玻璃微珠破碎，分别提取S. carnosusTM300重组菌株与对照菌株的细胞壁和原生质体进行SDSPAGE蛋白电泳，结果见图6．同时对其发酵液进行蛋白电泳分析，以确定GFP是否能够分泌到宿主细胞外的培养基中．

本研究中，经N-末端修饰的目的蛋白GFP的相对分子质量约为3×104．在图6中重组菌株细胞壁部位所在的泳道出现了目的条带，这表明GFP蛋白成功表达并转运到肉葡萄球菌宿主细胞的细胞壁部位．但是发酵液的蛋白电泳图在目的位置没有出现目的条带，说明GFP蛋白未能分泌到胞外(图略)．

2.6 Native-PAGE分析

为检测重组菌株表达的GFP是否具有活性，提取出E. coli DH5α 重组菌株、S. carnosusTM300重组菌株及其对照菌株的细胞壁和原生质体进行了Native-PAGE活性蛋白电泳，结果如图7所示．

在图7中可以看出，如箭头所指方向，GFP目的条带出现在重组菌株S. carnosusTM300/pBT2-ETG的细胞壁部位(泳道6)，这表明重组菌株S. carnosusTM300/pBT2-ETG表达的活性GFP成功地分泌到了宿主细胞壁部位．

3 结 语

本实验在构建大肠杆菌–肉葡萄球菌穿梭质粒pBT2-ETG的过程中，先将目的基因与构建的连接产

物高效地转化入大肠杆菌，通过大肠杆菌繁殖扩增获得了大量重组质粒，再提取此重组质粒电转化入肉葡萄球菌，从而较好地解决了连接产物直接转化肉葡萄球菌效率较低的问题．

穿梭质粒pBT2-Tat-GFP引入的强启动子Peftu可以使融合基因tat-gfp在大肠杆菌与肉葡萄球菌宿主中均得到高效表达，并通过Tat信号肽的作用，将GFP正确折叠并转运至肉葡萄球菌细胞壁部位．该强启动子通过提高外源蛋白在肉葡萄球菌中的表达效率，使得pBT2表达载体系统易于进行克隆操作．本研究的成果也为相应的细胞表面展示与活菌疫苗等的研发奠定了理论与应用的基础．

致谢：本文受天津市高等学校科技发展基金资助(项目编号：20120803)，谨致谢忱！

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责任编辑：常涛

GFP Translocation of Twin-arginine Secretion Pathway in Staphylococcus carnosus

GAO Qiang1，XU Baoyin1，CHENG Yibing1，WANG Lin2，ZHANG Chaozhen1，TIAN Pingping1

(1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. College of Computer Science and Information Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300222，China)

According to the genome sequence ofStaphylococcus carnosusTM300 genome，a pair of primers was designed for PCR amplification of promoter Peftu of tufA gene. The PCR-amplified promoter Peftu fragment was cloned into plasmid pBT2-Tat-GFP and chemically transformed into E. coli host. A shuttle vector pBT2-ETG was thereby constructed and successfully transformed intoE. coli and S. carnosusTM300 hosts，respectively. The experimental results reveal that GFP was expressed by theE. coli-Staphylococcusshuttle vector pBT2-ETG in bothE. coliandS. carnosushosts. The expressed GFP was translocated to the cell walls of S. carnosus host in fluorescent active form. Thereby，a preliminary experimental basis was laid for the further study of other exogenous protein secretion via twin-arginine translocation pathway inS. carnosus.

Staphylococcus carnosus；GFP；twin-arginine translocation pathway；promoter Peftu；Tat signal peptide

Q933

A

1672-6510(2014)05-0001-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.05.001

2014–01–18；

2014–04–20

国家自然科学基金资助项目(31370075，31101275)；国家高技术研究发展计划“863计划”资助项目(2012AA021302)

高 强（1965—），男，陕西府谷人，教授，gaoqiang@tust.edu.cn.