结直肠息肉、结直肠腺瘤和结直肠癌患者外周血中Th17和Tc17细胞的变化

王建升 张立志 帖彦清 吕元鹏 宋津晓

结直肠息肉、结直肠腺瘤和结直肠癌患者外周血中Th17和Tc17细胞的变化

王建升 张立志 帖彦清 吕元鹏 宋津晓

目的 检测结直肠息肉、结直肠腺瘤和结直肠癌患者外周血中辅助性T细胞（Th）17与杀伤性T细胞（Tc）17细胞比例的变化，并分析两者的相关性。方法收集结直肠息肉17例、结直肠腺瘤34例和结直肠癌42例患者资料，另取17名健康志愿者为对照。流式细胞术检测患者和健康对照外周血中Th17和Tc17细胞比例；ELISA法检测血清中白细胞介素（IL）-17A和IL-23水平。结果结直肠腺癌组患者外周血中Th17和Tc17细胞比例以及IL-17A和IL-23水平最高，结直肠腺瘤及息肉组较高，对照组两种细胞比例及两因子水平最低，结直肠腺瘤组Tc17细胞比例高于结直肠息肉组，但两组Th17细胞比例、IL-17A和IL-23水平差异无统计学意义。相关性分析表明Th17和Tc17细胞呈正相关（rs=0.594）。结论在结直肠息肉或结直肠腺瘤向结直肠癌发展中，外周血Th17和Tc17细胞比例均明显增多，且两者呈正相关。

细胞因子类；结直肠息肉；结直肠腺瘤；结直肠癌；Th17细胞；Tc17细胞

结直肠癌是消化系统最常见的一类肿瘤，其病因复杂，目前仍不清楚。有证据表明，在结直肠癌的发生发展过程中大多会涉及机体的免疫细胞和免疫因子的异常[1-2]。辅助性T细胞（Th）17/杀伤性T细胞（Tc）17是一类由初始CD4+T/CD8+T细胞分化而来的效应T细胞，它们参与了肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病的发生和发展[3-4]。目前，关于Th17和Tc17细胞及其相关细胞因子白细胞介素（IL）-17A、IL-23在结直肠癌发展过程中的变化情况，国内尚鲜见报道。本研究检测结直肠息肉、结直肠腺瘤和结直肠癌患者外周血中Th17和Tc17细胞比例变化，并检测患者血清中IL-17A和IL-23水平的变化，旨在进一步探讨结直肠癌发生发展中的免疫病理机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2010年6月—2012年12月结直肠息肉、结直肠腺瘤和结直肠腺癌患者。所有患者的血标本收集前均未行放射治疗、化学治疗、生物治疗及中西医结合治疗。排除有癌家族史、自身免疫性疾病、感染性疾病、炎性肠病及家族性息肉者。所有患者均经病理诊断证实且确定其病理类型。其中结直肠息肉组17例（结肠息肉9例，直肠息肉8例），男7例、女10例，平均年龄（62.2±8.4）岁；结直肠腺瘤组34例（结肠腺瘤20例，直肠腺瘤14例），男21例、女13例，平均年龄（65.2±9.1）岁；结直肠腺癌组42例（结肠腺癌18例，直肠腺癌24例），男20例、女22例，平均年龄（64.5±11.9）岁。选择同期在我院进行体检的健康人群17例为健康对照组，男10例、女7例，平均年龄（63.6±9.4）岁。各组年龄（F=0.353）、性别（χ2=2.717）差异无统计学意义（P＞0.05）。所有受试者均签署知情同意书，并报伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 Ficoll-Hypaque分离液购自Sigma公司；佛波酯、离子霉素、布雷菲得菌素A、FIX&PERM Kit Reagent、鼠抗人CD3、CD8、IL-17A及其相应的同型对照、IL-17A、IL-23酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒均购自eBioscience公司。

1.3 标本收集 所有受试对象于清晨抽取空腹外周血,其中4 mL置入肝素钠抗凝管内，Ficoll-Hypaque液分离外周血单个核细胞（PBMCs）用于流式细胞学检测；5 mL外周血离心后取血清储存于-80℃以备分析IL-17A和IL-23用。

1.4 Th17和Tc17细胞流式检测 分离的PBMCs以1×106/mL铺于48孔培养板各孔中，每孔加入1 mg/L离子霉素和25 mg/L佛波酯各20 μL，然后加入10 mg/L布雷菲得菌素A 20 μL，于5%CO2孵箱37℃孵育5 h。用FITC标记的鼠抗人CD8单抗和PE-Cy5标记的鼠抗人CD3单抗进行细胞表面分子染色，通过Reagent A固定、Reagent B破膜后再用PE标记的抗人IL-17A单抗标记胞内抗体，0.5 mL 1%多聚甲醛PBS重悬细胞，流式细胞仪检测，采用CellQuest分析软件对结果进行分析。Th17细胞以CD3+、CD8-、IL-17+T细胞在CD4+T细胞中的百分比表示；Tc17细胞以CD3+、CD8+、IL-17+T细胞在CD3+T细胞中的百分比表示。

1.5 ELISA检测IL-17A和IL-23水平 收集所有受试对象的血清,用双抗体夹心法进行人IL-17A和IL-23的检测。操作过程均按ELISA试剂盒说明书进行。

1.6 统计学方法 所有数据采用SPSS 17.0软件包进行统计学分析，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验；非正态数据用M(P25,P75)表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验，2组间比较采用Mann-Whitney检验。相关分析采用Spearman相关分析法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组外周血中Th17和Tc17细胞比例变化 4组Th17细胞和Tc17细胞比例差异有统计学意义（P＜0.01），其中结直肠腺癌组两种细胞比例最高，健康对照组两种细胞比例最低，结直肠腺瘤组Tc17细胞比例高于结直肠息肉组（P＜0.05），但2组Th17细胞比例差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 各组外周血中IL-17A和IL-23水平变化 各组IL-17A和IL-23水平差异有统计学意义，其中结直肠腺癌组两种因子水平均最高，健康对照组水平最低（P＜0.05），而结直肠息肉组和结直肠腺瘤组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

Table 2 Comparison of the serum levels of IL-17A and IL-23 in healthy control groups and patient groups表2 各组血清中IL-17A和IL-23水平结果比较（μg/L，±s）

＊＊P＜0.01；a与（1）比较，b与（2）比较，c与（3）比较，P＜0.05

组别健康对照组（1）结直肠息肉组（2）结直肠腺瘤组（3）结直肠腺癌组（4）F n 17 17 34 42 IL-17A 4.65±2.59 7.19±3.67a7.50±3.81a12.89±11.94abc5.781＊＊IL-23 16.87±8.83 38.67±27.86a38.06±27.41a58.05±35.00abc8.862＊＊

2.3 各组外周血中Th17细胞、Tc17细胞、IL-17A和IL-23相关性分析 Th17和Tc17细胞呈正相关（rs=0.594）。Th17细胞与IL-17A（rs=0.829）和IL-23（rs=0.442）呈正相关。Tc17细胞与IL-17A（rs=0.337）和IL-23（rs=0.585）呈正相关（均P＜0.01）。

3 讨论

3.1 Th17细胞在肿瘤中的变化 Th17细胞是近年来发现的一类新型细胞亚群，介导炎性反应，在慢性炎症、自身免疫性疾病和移植排斥反应的发生和发展中发挥重要的作用[5-6]，但对Th17细胞在肿瘤免疫中的作用及意义目前尚不完全清楚。越来越多的证据表明,荷瘤小鼠和多种肿瘤患者的外周血、瘤组织、骨髓、脾等检测到了高水平的Th17细胞[7]。进一步分析表明，Th17细胞高水平并非肿瘤特异性的，在人卵巢癌晚期、胰腺癌及肾癌中也发现了Th17细胞的高表达，且相应肿瘤组织中的Th17细胞随着肿瘤的发展也逐渐增多[7]，表明Th17细胞高表达是肿瘤患者的一个普遍特征。但Th17细胞及其特征细胞因子IL-17A究竟是起促进、还是抑制肿瘤的作用，目前仍存在争议[8]。

3.2 Th17细胞及其相关细胞因子在结直肠癌发生发展中的作用 动物实验证实，Th17细胞及其相关细胞因子IL-17A和IL-23介导的炎性反应能诱导肠腺瘤和结肠癌的发生[8]。鼠腺瘤模型的瘤组织中存在异常增多的不能分泌IL-10的调节性T（Treg）细胞，这种异常的Treg细胞不能有效地控制Th17细胞介导的炎性反应，从而导致腺瘤的发展[9]。在产生肠毒素的脆弱类杆菌（ETBF）引发的肠炎和结肠癌鼠模型中，ETBF能引发较强的Th17细胞炎性反应，这种炎性反应最终导致肠炎和结肠肿瘤的形成，但Tc17细胞在此过程中的作用不明显[10]。IL-17A在“腺瘤→腺癌”顺序中的腺瘤期就表达异常，其高表达与肠上皮不典型增生程度密切相关[11]。本研究表明，结直肠息肉、结直肠腺瘤和结直肠癌患者外周血中Th17细胞比例均高于健康对照，从结直肠息肉或结直肠腺瘤到结直肠癌发展中，其数量明显增多，其相关细胞因子IL-17A和IL-23也呈现类似的变化趋势。相关性分析表明，Th17细胞与IL-17A、IL-23呈正相关，提示Th17细胞及其相关因子IL-17A和IL-23可能参与了人结直肠癌发生发展的免疫病理过程。

3.3 Tc17细胞在肿瘤中的表达 Tc17细胞是近年来发现的又一类新型细胞亚群，其在感染性疾病和自身免疫性疾病中的研究颇多，但在肿瘤尤其是结直肠癌中的报道较少。胃癌患者外周血和肿瘤组织中的Tc17细胞随着疾病的进展而增加，且肿瘤组织中的Tc17细胞比例明显高于外周血，高比例的Tc17细胞与胃癌患者的总生存期和无病生存期呈负相关，并可作为一个独立的预测预后的指标[12]。与健康人外周血相比，鼻咽癌患者外周血中有低比例Tc17细胞，而瘤组织则存在高比例Tc17细胞，这是因为Tc17细胞能高表达趋化因子受体6（CCR6），而肿瘤组织高表达CC型趋化因子配体20（CCL20），后者能募集Tc17细胞到肿瘤微环境中，致使患者外周血中的Tc17细胞数量减少[13]。本研究表明，结直肠息肉、结直肠腺瘤和结直肠癌患者外周血中Tc17细胞比例都高于健康对照，从结直肠息肉到结直肠腺瘤再到结直肠癌，其数量逐渐增多。相关性分析表明，Tc17细胞不仅与IL-17A和IL-23呈正相关，而且与Th17细胞呈正相关。但结直肠腺瘤组Tc17细胞比例高于结直肠息肉组，而两组Th17细胞比例无明显差异，提示Tc17细胞和Th17细胞的分化调控可能存在一些差异。

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（2013-07-18收稿 2013-12-06修回）

（本文编辑 李鹏）

The Changes of Circulating Th17 and Tc17 Cells in Patients with Colorectal Polyp, Adenoma and Cancer

WANG Jiansheng,ZHANG Lizhi,TIE Yanqing,LYU Yuanpeng,SONG Jinxiao
Clinical Laboratory，Hebei General Hospital,Hebei 050051,China

Objective To compare ratio of circulating Th17 over Tc17 cells in patients with colorectal polyp(CRP), colorectal adenoma(CRA)and colorectal cancer(CRC)，and analyse their relationship.MethodsThe ratio of circulating Th17 over Tc17 cells in 93 patients（17 CRP,34 CRA and 42 CRC）and 17 healthy donors were examined by flow cytometry; Serum levels of IL-17A and IL-23 were tested by ELISA.ResultsThe ratio of circulating Th17 over Tc17 cells and the serum levels of IL-17A and IL-23 were the lowest in healthy control groups,medium in CRP and CRA groups and the highest in CRC groups(P＜0.05).The proportions of Tc17 cells in CRA groups were significantly higher compared to those in CRP groups，but no statistical significance of proportion of circulating Th17 cells as well as serum levels of IL-17A and IL-23 between CRA and CRP groups was observed(P＞0.05).Further analysis showed that there was a positive correlation between proportions of circulating Th17 and Tc17 cells(rs=0.594,P＜0.001).ConclusionThe proportions of circulating Th17 and Tc17 cells were positively related and the ratio of Th17 over Tc17 was markedly increased from CRP group or CRA group to CRC group.

cytokines；colorectal polyp；colorectal adenoma；colorectal cancer；Th17 cells；Tc17 cells

R735.3

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.007

河北省人民医院检验科（邮编050051）