短期胰岛素刺激对HIT-T15细胞胰岛素原基因表达的影响*

张 君 荣 曦 吴宇娟 刘 红

细胞与分子生物学

短期胰岛素刺激对HIT-T15细胞胰岛素原基因表达的影响*

张 君 荣 曦 吴宇娟 刘 红△

目的 探讨短期外源性胰岛素刺激对HIT-T15胰岛β细胞胰岛素原（PI）基因表达的影响及机制。方法HIT-T15仓鼠胰岛瘤细胞随机分为4组：含1.4 mmol/L葡萄糖完全培养基组作为空白对照(LG组)，为抑制内源性胰岛素释放干扰以低糖联合硝苯地平作为条件对照（LGC组），在LGC基础上分别加0.5 U/L或5 U/L的外源性胰岛素作为实验组(分别为LINS组和HINS组)，分别在刺激后0、30、60、90、120 min以荧光定量PCR检测各组PI mRNA，免疫组化检测各组细胞胰岛素受体底物1（IRS1）酪氨酸磷酸化水平。结果（1）LINS组、HINS组细胞PI mRNA表达均上调，在刺激后60 min PI mRNA表达量达高峰。（2）实验组在刺激后30 min IRS1酪氨酸磷酸化水平较对照组明显增高，高、低浓度胰岛素组细胞酪氨酸磷酸化达高峰时间不同。（3）LG组和LGC组间PI mRNA表达及IRS1酪氨酸磷酸化水平无明显差异。结论短期外源性胰岛素能上调胰岛β细胞PI基因的表达，且高浓度的胰岛素较低浓度胰岛素作用强。PI表达调控与IRS1信号传导有关。

胰岛素原；胰岛素分泌细胞；硝苯地平；胰岛素受体底物1；酪氨酸磷酸化；HIT-T15细胞

胰岛素合成与分泌的严格而快速的调控，对维持机体血糖在正常范围内波动至关重要。胰岛β细胞分泌胰岛素后，短时间内其可通过胰岛素基因的转录和翻译迅速补充储存池内丢失的胰岛素，维持细胞胰岛素分泌颗粒的储存平衡。近期有研究发现胰岛细胞对胰岛素有自分泌调节作用，葡萄糖刺激后分泌的胰岛素可通过与胰岛β细胞自身胰岛素受体结合，从而促进胰岛素分泌[1]。胰岛素的分泌与合成是胰岛β细胞维持其自身胰岛素代谢平衡的两大关键细胞生物学行为。而目前关于自分泌作用对胰岛细胞自身胰岛素基因表达的影响还知之甚少。本研究以体外培养HIT-T15仓鼠胰岛瘤细胞为研究对象，观察短期外源性胰岛素刺激对胰岛β细胞信号传导元件底物水平磷酸化及胰岛素原（proinsulin, PI）基因表达的影响，探讨外源性胰岛素作用对胰岛β细胞自身胰岛素合成的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及材料 75～80代HIT-T15仓鼠胰岛瘤细胞（美国ATCC细胞库），1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、EDTA（GIBCO公司，美国），硝苯地平片（中诺药业有限公司），中性胰岛素（江苏万邦生物医药有限公司），PI基因引物合成、逆转录试剂盒、PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司），胰岛素受体底物（IRS）1酪氨酸磷酸化免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司），倒置显微镜（Olympus，日本），CO2恒温细胞培养箱（HERAUESEK Type，德国），细胞培养板（洁特，加拿大），Bio-Rad C1000荧光定量PCR扩增仪(Bio-Rad公司，美国)，Leica病理图像分析仪（DMR+Q550型，德国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取对数生长的HIT-T15细胞，经胰酶消化后以细胞密度为1×106/mL种于6孔板内。加入含有10%胎牛血清、100 U/mL链霉素、100 U/mL青霉素，10%FBS，1 mmol/L的丙酮酸钠及1 mmol/L L-谷氨酰胺的1640培养基（含11.1 mmol/L葡萄糖），置于含有5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24 h，开始后续实验。

1.2.2 细胞分组 加入刺激因素前6 h将细胞置于含5.6 mmol/L完全培养基中预处理。为抑制内源性胰岛素的干扰，在加入胰岛素刺激前30 min加入10 μmol/L硝苯地平刺激。实验分组：（1）对照组（LG组）。细胞与含1.4 mmol/L葡萄糖培养基作用。（2）硝苯地平组（LGC组）。细胞在含1.4 mmol/L葡萄糖培养基中生长，同时加入10 μmol/L硝苯地平刺激。（3）低胰岛素刺激组（LINS组）。细胞与含10 μmol/L硝苯地平及0.5 U/L胰岛素的培养基共同作用。（4）高胰岛素刺激组（HINS组）。细胞与含10 μmol/L硝苯地平及5 U/L胰岛素的培养基共同作用。分别在刺激后0、30、60、90、120 min收取细胞。

1.2.3 PI基因表达检测 以Trizol试剂抽提培养细胞总RNA，逆转录试剂盒逆转录为cDNA。PI引物：上游5′-CGTGGCTTCTTCTACACACCC-3′，下游5′-AGCTCCAGTTGTGCCACTTGT-3′，产物257 bp。内参β-actin引物：上游5′-GGAGTTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，产物274 bp。按照TaKaRa SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒说明，PCR总反应体系20 μL；扩增条件：95℃预变性30 s，然后95℃变性5 s，60℃退火32 s，60℃延伸1 min条件下循环40次。采用Bio-Rad C1000荧光定量PCR扩增仪进行检测。CT值由软件自动分析获得，用2-△△Ct法计算分析。

1.2.4 免疫组织化学染色 不同时间点取出的细胞爬片，体积分数为4%多聚甲醛固定15 min，体积分数3%H2O2溶液灭活内源性过氧化物酶。0.25%TritonX-100处理。非免疫动物血清室温下封闭30 min，滴兔抗大鼠IRS-1酪氨酸磷酸化一抗（1∶400稀释）；滴加辣根过氧化物酶标记二抗。DAB显色，苏木精轻度复染，逐级脱水、透明、封固。镜下观察，胞浆内有棕黄色颗粒为阳性。采用Leica病理图像分析仪对所有免疫组化染色标本进行分析。每张玻片均随机读取4个不连续的高倍镜视野（×400），每个视野读取10个细胞胞质着色处测定灰度值，灰度值与蛋白表达量成反比关系，灰度值越低，IRS1表达量越高。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行分析。数据以均数±标准差（s）表示，多组间比较及组内刺激前后比较应用单因素方差分析，组间多重比较方差齐时用SNK法，方差不齐时用Games-Howell法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组胰岛细胞PI mRNA表达水平比较 （1）组内比较。随刺激时间延长两胰岛素刺激组PI mRNA表达量均逐渐升高，在刺激60 min达高峰，随后逐渐降低。而LG组及LGC组未见上述变化。（2）组间比较。刺激0 min时各组PI mRNA表达差异无统计学意义。刺激30 min及以后各时间点，两胰岛素刺激组PI mRNA表达均较LG组明显上调，且HINS组较LINS组上调更明显（均P＜0.05）。应用Ca2+阻滞剂硝苯地平并不影响PI基因的表达，与LG组相比各时间点差异均无统计学意义。见表1。

Table 1 Comparison of PI mRNA expression at different time points between four groups表1 各组间不同时间点PI mRNA表达比较 （n=3±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01。横向组内比较：a与0 min比较，b与60 min相比，c与90 min相比，P＜0.05。纵向组间比较：d与LG组相比，e与LINS组比较，P＜0.05。表2同

组别LG组LGC组LINS组HINS组F刺激0 min 0.73±0.02 0.69±0.07 0.71±0.07 0.68±0.03 0.557刺激30 min 0.66±0.09 0.73±0.09 0.79±0.02d0.86±0.04ade4.625＊刺激60 min 0.67±0.11 0.68±0.11 1.11±0.06ad1.31±0.04ade27.411＊＊刺激90 min 0.65±0.11 0.63±0.08 0.99±0.08abd1.20±0.10abde59.415＊＊刺激120 min 0.65±0.09 0.64±0.12 0.85±0.06abcd1.13±0.08abde23.296＊＊F 0.499 0.607 22.835＊＊49.586＊＊

2.2 各组IRS1酪氨酸磷酸化水平比较 见表2、图1。（1）组内比较。LINS组、HINS组各时间点较0 min相比均明显升高（P＜0.05）。两胰岛素刺激组均在刺激30 min后升高，其中LINS组在刺激后60 min、HINS组在刺激后90 min达高峰。LGC组、LG组随时间延长无明显改变。（2）组间比较。0 min时各组间差异无统计学意义。LINS组自刺激后60 min、HINS组自刺激后30 min明显高于LG组（P＜ 0.05）。应用硝苯地平处理并不影响IRS1磷酸化水平，LG组与LGC组各时间点差异无统计学意义。

Table 2 Comparison of IRS1 tyrosine phosphorylation expression at different time points between four groups表2 各组间不同时间点IRS1酪氨酸磷酸化表达平均灰度值比较 （n=4±s）

注：灰度值越低，IRSI表达量越高

组别LG组LGC组LINS组HINS组F刺激0 min 124.83±2.89 123.28±0.85 124.18±1.51 123.73±1.90 0.468刺激30 min 121.85±1.99 122.08±1.00 118.28±2.72a116.28±1.76ade8.266＊刺激60 min 122.05±1.40 122.05±3.14 116.35±1.00ad117.42±2.21ad8.183＊刺激90 min 121.23±1.96 123.58±2.59 117.35±1.04ad113.48±2.48abde17.742＊＊刺激120 min 120.98±3.44 123.25±1.37 118.83±2.16abd114.20±1.04abde12.672＊＊F 1.582 0.521 11.605＊＊17.590＊＊

3 讨论

葡萄糖是促进胰岛素分泌的有效刺激因子，调节胰岛β细胞胰岛素的分泌是维持血糖在生理范围内波动的有效方式[2]。早在1980年Verpohl等采用传统的放射性配体结合实验证实了β细胞是胰岛素作用的靶细胞。在生理血糖范围内，胰岛素与葡萄糖一样，通过激活胰岛β细胞胰岛素受体及下游的IRS1/PI3K途径使β细胞内Ca2+浓度升高，从而促进胰岛素的分泌[3-4]。目前大部分研究多认为胰岛素能直接促进胰岛β细胞分泌胰岛素[5-6]，但此分泌作用是通过调节钙离子通道使胰岛β细胞胞吐作用增强引起还是与PI基因表达有关，目前尚有争议[7]。

本研究为抑制内源性胰岛素对实验干扰，在胰岛素刺激前30 min加入钙离子通道阻滞剂硝苯地平。钙离子对调节胰岛素的分泌必不可少。细胞内钙离子浓度的升高能促进含胰岛素颗粒的突触囊泡向细胞膜移动，促进胰岛素以胞吐形式释放，但不影响胰岛素基因表达[8]。本研究中LGC组、LG组PI基因表达无差异，而予高、低2种不同浓度外源性胰岛素刺激后PI基因表达量逐渐增加，且随刺激胰岛素浓度的增高而呈现剂量依赖关系，表明胰岛素对胰岛β细胞PI基因的表达有直接促进作用。但进一步增加胰岛素刺激浓度，能否仍然上调PI基因的表达，有待进一步研究。

IRS是胰岛素信号传导的主要元件，分为IRS1、IRS2。Leibiger等[9]研究表明胰岛素能通过顺序性激活IRS1及PI3K下游的p70s6k和PKB/AKT途径分别促进胰岛素和葡萄糖激酶的基因转录和合成，形成胰岛β细胞胰岛素的自分泌通路，使胰岛素能刺激自身的合成。此外IRS1磷酸化也能通过影响细胞内钙离子内流，而促进胰岛细胞脱颗粒，分泌胰岛素[10]。IRS1基因敲除的小鼠（IRS1 KO）表现出明显高胰岛素血症及胰岛细胞明显增生，而PI基因表达量未见明显增加[11]。由此说明胰岛β细胞IRS1酪氨酸磷酸化水平与PI基因表达量呈正相关。本研究结果显示，胰岛素刺激后除有PI基因表达量增加外，IRS1酪氨酸磷酸化水平也逐渐升高，其中HINS组IRS1酪氨酸磷酸化水平较LINS组明显升高，其磷酸化水平峰值时间与PI基因表达基本一致，提示胰岛素对胰岛β细胞PI基因的调节可能是通过IR/ IRS1酪氨酸磷酸化信号通路实现。

在生理状态下胰岛β细胞能以脉冲的形式分泌胰岛素，且这种分泌方式受胰岛β细胞产生的多种因子的正反馈调节，其中胰岛素便是其调节因子之一[12]。2型糖尿病患者由于胰岛素抵抗及β细胞功能受损使胰岛素脉冲式周期分泌节律失调[13]。增加外源性胰岛素能保持糖尿病患者血糖稳定，并在一定程度上能促进胰岛细胞功能的恢复[14]。本研究表明在生理糖浓度条件下短期胰岛素刺激对PI基因的表达有正性反馈调节作用。基于这一观点，胰岛素除了起到2型糖尿病替代治疗作用外，也可能通过对转录和翻译水平的调节，促进胰岛素的分泌，从而更好维持血糖平衡。但是否长期刺激后此效应仍然存在及这种正反馈如何维持血糖平衡尚有待进一步研究。

[1]Leibiger B,Moede T,Uhles S,et al.Insulin-feedback via PI3KC2α activated PKBα/Akt1 is required for glucose-stimulated insulin secretion[J].FASEB J,2010,24(6):1824-1837.

[2]Melloul D,Marshak S,Cerasi E.Regulation of insulin gene transcription[J].Diabetologia，2002,45(3):309-326.

[3]Braun M,Ramracheya R,Rorsman P.Autocrine regulation of insulin secretion[J].Diabetes Obes Metab,2012,14(s3):143-151.

[4]Leibiger IB,Leibiger B,Berggren PO.Insulin signaling in the pancreatic β-cell[J].Annu Rev Nutr,2008,28:233-251.

[5]Bouche C,Lopez X,Fleischman A,et al.Insulin enhances glucosestimulated insulin secretion in healthy humans[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(10):4770-4775.

[6]Dai XQ,Manning Fox JE,Chikvashvili D,et al.The voltage-dependent potassium channel subunit Kv2.1 regulates insulin secretion from rodent and human islets independently of its electrical function [J].Diabetologia,2012,55(6):1709-1720.

[7]Rhodes CJ,White MF,Leahy JL,et al.Direct autocrine action of insulin on β-cells:does it make physiological sense[J]?Diabetes, 2013,62(7):2157-2163.

[8]陈宇红,刘长勤,李小英,等.钙离子通道阻滞剂影响胰岛功能吗[J]?中华内分泌代谢杂志，2005,21(4):407-408.

[9]Leibiger B,Moede T,Schwarz T,et al.Short-term regulation of insulin gene transcription by glucose[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 1998,95(16):9307-9312.

[10]Assmann A,Ueki K,Winnay JN,et al.Glucose effects on beta-cell growth and survival require activation of insulin receptors and insulin receptor substrate 2[J].Mol Cell Biol,2009,29(11):3219-3228.

[11]Koh A,Lee MN,Yang YR,et al.C1-Ten is a protein tyrosine phosphatase of insulin receptor substrate 1(IRS-1),regulating IRS-1 stability and muscle atrophy[J].Mol Cell Biol,2013,33(8):1608-1620.

[12]于浩泳,吴海娅,贾伟平.胰岛素脉冲样分泌的机制及临床意义[J].中华内分泌代谢杂志，2005,21(3):285-287.

[13]Wahren J,Kallas Å.Loss of pulsatile insulin secretion:a factor in the pathogenesis of type 2 diabetes[J]?Diabetes,2012,61(9):2228-2229.

[14]李光伟.关于2型糖尿病早期胰岛素强化治疗的思考[J].中华内科杂志,2010,49(1):1-2.

（2013-09-20收稿 2013-12-13修回）

（本文编辑 李国琪）

The Short Term Effect of Insulin on Proinsulin Gene Expression of HIT-T15 Insulinnoma Cells

ZHANG Jun,RONG Xi,WU Yujuan,LIU Hong
Department of Geriatric Endocrinology,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Guangxi 530021,China

ObjectiveTo investigate the short term effect of insulin on proinsulin gene expression of HIT-T15 insulinnoma cells（pancreatic islet β-cell）.MethodsThe HIT-T15 cells were randomly divided into four groups.Blank Control Group(LG):complete medium contain 1.4 mmol/L glucose.Control group(LGC)：co-cultured nifedipine with medium in order to restain endogenous insulin release.Experimental group(LINS or HINS)add 0.5 U/L insulin or 5 U/L insulin on top of LGC.After being stimulated for 0,30,60,90,120 mins,proinsulin(PI)mRNA level were assessed by semi-quantitative RT-PCR.Insulin receptor substrate1(IRS1)tyrosine phosphorylation was detected by immunocytochemistry.Results(1) Expression of PI was up regulated by both LINS and HINS,and peak at 60 mins.(2)After stimulation for 30 mins,the level of IRS1 tyrosine phosphorylation in the experimental group was significantly higher than control group,and the peak time between LINS and HINS was different.(3)Between group of LG and LGC,the expression of PI mRNA and IRS1 tyrosine phosphorylation show no difference.ConclusionShort term exogenous insulin stimulation can promote expression of proinsulin genes，which is concentration dependent.The expression and regulation of PI were related with IRS1 signal transduction.

proinsulin;insulin-secreting cells;nifedipine;insulin receptor substrate1;tyrosine phosphorylation; HIT-T15 cells

R587.1

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.001

*国家自然科学基金资助项目（项目编号：31160189）

广西医科大学第一附属医院老年内分泌科（邮编530021）

△通讯作者 E-mail：hongmm1@qq.com