加味四物汤对血小板减少性紫癜小鼠影响的实验研究＊

冯晓燕，顾 鸿，杨长福，施建南，严鲁萍

（贵阳中医学院，贵州贵阳520002）

特发性血小板减少性紫癜（ITP）是一组因外周血中血小板减少而导致皮肤、黏膜或内脏出血的疾病，发病率很高，临床约占出血疾病总数的30%。加味四物汤是贵州省省级名老中医严鲁萍教授和贵阳中医学院第二附属医院血液内科生医在四物汤的基础上总结多年的临床经验，不断探索而成，该方剂用于治疗ITP疗效显著。为研究加味四物汤对ITP的药效及作用机制，本科用免疫法建立ITP动物模型，对此方进行动物实验研究，探讨该药的临床作用及其与免疫因素的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物与药物 KM小鼠74只，体质量18～22g雌雄各半，SPF级，由长沙市开福区东创实验动物科技服务部提供，合格证号：SCXK（湘）2009-0012。戊巴比妥钠，Sigma公司产品（货号：P3761）。醋酸泼尼松，市售，浙江仙琚制药股份有限公司生产，国药准字H133021207，生产批号：1205150。加味四物汤（当归15g、白芍15g、熟地12g、川芎15g、太子参10 g、紫珠草24g、土大黄24g、枸杞10g、黄芪25g、茜草根12g、侧柏叶10g），由贵阳中医学院第二附属医院药剂科提供。将上述药物按人和动物比例折算用量，用蒸馏水浸泡30min，煎煮2次（30分钟／次）后，过滤、合并滤液并加热蒸发，制成100%水煎浓液（含生药量为1g／mL），于4℃冰箱中保存备用，使用时常温静置40min、充分摇匀。

1.2 仪器与试剂 Muctiskan Go酶标仪为Thermo公司生产。Sysmex XT-2000i全自动血细胞计数仪，日本生产；IL-6试剂盒由R＆D公司提供，生产编号：10-27-907。80-2离心沉淀器由上海手术器厂生产，弗氏完全佐剂（FCA）和弗氏不完全佐剂（FICA）为Sigma公司产品。

1.3 方法

1.3.1 豚鼠抗小鼠血小板血清（GP-APS）的制备 取KM小鼠，5%戊巴比妥钠麻醉，眼球取全血，乙二胺四乙酸－二钠（EDTA-Na2）抗凝，离心分离血小板，调整血小板数至1×109／mL；取分离的血小板分别与等量FCA和FICA混合成油包水状做抗原，取含FCA抗原1mL于0周注射豚鼠足掌、背及腹部皮下至少6位点，取含FICA抗原1mL分别于1、2、4周注射于豚鼠足掌、背及腹部皮下，每次至少6点，第5周从豚鼠心脏取不抗凝全血，离心分离血清即为GP-APS，分装贮存于－20℃冰箱。将GP-APS从－20℃冰箱取出，56℃水浴30 min，用等量KM小鼠红细胞吸附2次，用生理盐水稀释成1∶4浓度待用。

1.3.2 造模与分组 KM小鼠74只，随机分成健康组14只、模型生理盐水组20只、西药组20只和中药组20只，每组雌雄各半。除健康组外，各组参照参考文献［1-3］造模方法并加以改进，隔日1次按每20g／100μL腹腔注射1∶4稀释的GPAPS，造模第8天开始各组均按每20g 0.2mL剂量灌胃，连续10d；其中，模型生理盐水组按每20g 0.2mL剂量灌胃给生理盐水，西药组以泼尼松按成人60mg／d剂量换算后，按每10g 0.01mg剂量灌胃，中药组按每20g 0.2mL剂量灌胃。

1.4 指标及检测方法 实验中观察小鼠的活动量，饮食饮水量，皮毛光泽度、皮肤淤血出血、体质量改变及死亡数量等基本情况。实验结束后通过股动脉取血，EDTA-Na2抗凝，采用全自动血细胞记数分析仪检测外周血，离心分离血清，采用双抗夹心ELISA法，按试剂盒说明方法测定血清IL-6水平。按文献［4］方法快速剥离股骨，用6号针头以1mL生理盐水冲出骨髓，置于EDTA-Na2抗凝管内，制成骨髓细胞悬液，采用全自动血细胞记数分析仪检测骨髓有核细胞数量。实验结束后处死小鼠，剖胸腹，取胸脾，置于电子天平上称质量；胸腺指数＝胸腺质量／体质量，脾脏指数＝脾脏质量／体质量。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行数据处理，实验结果以±s表示。对于满足正态性、方差齐性的多组数据之间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 实验动物一般情况 整个实验期间，正常组小鼠活动量大，行动敏捷，反应灵敏，毛色光泽，体质量均增加，实验结束时小鼠的体质量平均增加6g左右。模型组小鼠第1次注射GPAPS 1d后，开始逐渐出现眯眼、毛散乱竖起、活动量减少，鼻部颜色变白，饮食饮水量减少，体质量减轻等现象，造模后第8天模型组小鼠逐渐出现了较明显的皮下紫癜，实验结束时模型组小鼠体质量平均减轻7g左右。除健康组没有小鼠死亡外，西药组死亡6只，其中雌鼠4只，雄鼠2只；生理盐水组小鼠死亡8只，其中雌鼠6只，雄鼠2只；中药组小鼠死亡5只，雌鼠3只，雄鼠2只。

2.2 各组小鼠外周血象的变化 与正常组比较，模型组小鼠除RBC外 WBC、PLT均显著降低（P＜0.01）。西药组与中药组外周血WBC与PLT计数均明显上升（P＜0.05），但中药组上升更显著（P＜0.05）。西药组与中药组比较，外周血 WBC、RBC、PLT组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.3 各组小鼠骨髓有核细胞数的变化 与正常组比较，各实验组小鼠骨髓有核细胞数量显著降低（P＜0.01）。与模型生理盐水组比较，西药组与中药组骨髓有核细胞数量均增加，其中，西药组P＜0.05，中药组P＜0.05，见表2。

表1 各组小鼠外周血象

2.4 各组小鼠血清IL-6水平的变化 各模型组小鼠血清IL-6水平与健康组比较，均明显下降（P＜0.05），其中，模型生理盐水组下降最多（P＜0.01）。与生理盐水组比较，西药组、中药组血清IL-6水平均显著上升（P＞0.05），见表3。

2.5 各组小鼠胸脾指数变化 各模型组胸腺指数、脾脏指数与健康组比较均显著下降（P＜0.05），其中，模型生理盐水组下降最显著（P＜0.01）。与模型生理盐水组比较，西药组，中药组脾脏指数与胸腺指数均有显著上升（P＜0.05），见表4。

表2 各组小鼠骨髓有核细胞数

表3 各组小鼠血清IL-6水平

表4 各组小鼠脾脏、胸腺指数（±s）

表4 各组小鼠脾脏、胸腺指数（±s）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，与健康组比较；c：P＜0.05，d：P＜0.01，与模型生理盐水组比较。

组别 n 脾脏指数 胸腺指数健康组14 0.003 92±0.000 67 0.004 24±0.001 40模型生理盐水组 12 0.001 29±0.00047b 0.002 63±0.001 57b西药组 14 0.002 18±0.000 86da 0.003 81±0.001 42ac中药组 15 0.001 81±0.000 41db 0.003 99±0.001 49ac

3 讨 论

ITP属于中医“血证”、“发斑”、“肌衄”、“发斑”、“阴阳毒”“葡萄疫”等范畴，部分严重病例并发脑出血者可归属“中风”范畴。现代医学家将ITP命名为“紫癜病”［5］。目前，临床上西医主要应用止血药、糖皮质激素、免疫抑制剂、雄性激素、脾切除术和血浆置换、单抗和促细胞生成因子等进行治疗［6］，取得了一定的疗效。但西药治疗存在不良反应大、停药或减量易复发、易反弹等问题。近些年来，中医中药在本病的治疗上取得可喜的成绩，有了很大的进展［7－8］，在一定程度上弥补了西医治疗的不足，中药不良反应小，改善症状明显、费用相对低廉、治病根本等。四物汤是祖国医学中经典的补血名方，该方用血中之血药熟地、白芍配伍血中之气药当归、川芎，动静结合，刚柔相济，使血虚能补、血瘀能行、血燥能润、血溢能止，达到补血不滞血、和血不伤血的目的［9］。加味四物汤是在四物汤原方基础上，佐以益气健脾、养阴清热的中药而成。有研究表明，该药方能提升PLT水平、改善粒系病态造血，对再生障碍性贫血、ITP有较好疗效［10－11］。研究表明，黄芪及其合剂对PLT的恢复有促进作用［12］，促进骨髓粒系造血，使骨髓体外培养粒细胞、巨噬细胞（CFU-GM）集落数明显增加［13］。

ITP的病因和发病机制到目前仍不很明确，除了认为细菌或病毒感染与其发病有密切关系，与肝脾的作用有关外，不少的研究表明是体液免疫、细胞免疫及巨核细胞等的调控异常和人类细胞抗原遗传多态性等多方面综合作用的结果［14－15］。IL-6是一种由免疫活性细胞分泌的多功能因子，具有免疫调节及抗肿瘤作用，同时也有显著的造血调控作用。它的生物活性主要有促进B细胞增生分化和分泌抗体，活化T细胞和NK细胞、刺激肝细胞分泌急性肝细胞蛋白，促进造血干细胞增殖，使垂体分泌促肾上腺皮质激素，使形状细胞分泌神经生长因子样活性物质等。有研究表明细胞因子IL-6，sIL-2R参与了ITP的发病过程［16］。

本实验研究结果显示中药方剂加味四物汤具有与泼尼松一样能增加ITP模型小鼠外周血 WBC、PLT水平，促进骨髓有核细胞增殖，使血清IL-6的水平明显上升的作用。

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