肺癌患者外周血AKAP12基因甲基化水平的检测及意义

廖和和，张云锋，吴树强，李寒春，金 磊，任 宏

（1.陕西省核工业215医院肿瘤外科，陕西咸阳712000；2.西安交通大学第一附属医院胸外科，西安710061；3.西安医学院第一附属医院胸外肿瘤科，西安710077）

A激酶锚定蛋白12（A-kinase anchoring protein 12，AKAP12），在1992年由Gordon等［1］从重症肌无力患者的血清中分离得到。AKAP12能够锚定一些重要信号蛋白，参与了信号转导、G蛋白偶联受体蛋白信号转导、蛋白定向以及细胞凋亡等过程［2－3］。国内外研究发现，AKAP12在多种肿瘤中表达下降或缺失［4－5］，能够抑制肿瘤发生与转移［6－7］。目前，研究发现，外周血中存在高水平的游离DNA，其中很大一部分来源于凋亡或者坏死的肿瘤细胞，因此，检测血液标本中异常甲基化的DNA，能对疾病的诊断、预后及复发等提供新思路［8］。本研究采用甲基化特异－高分辨融解曲线法（MS-HRM）检测肺癌外周血细胞游离DNA中AKAP12基因甲基化程度，并结合患者病理参数进行分析研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2009年1月至2011年12月在陕西省核工业215医院和西安医学院第一附属医院就诊的60例肺癌患者，其中男32例，女28例，年龄28～76岁，平均（48.0±12.6）岁；均经病理确诊，Ⅰ期9例，Ⅱ期19例，Ⅲ期29例，Ⅳ3例；分化好及中等34例，分化差26例。收集患者外周血2～3 mL，分离去血清，－80℃冰箱保存备用。

1.2 试剂与材料 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit、Hot Star Taq Master Mix（Qiagen 公 司），EZ DNA Methylation-Gold Kit（ZYMO 公司），SYTO 9Green Fuorescent Nucleic Acid Stain（Invitrogen公司），CpGenome Universal Methylated DNA（Millipore公司）。PCR基因扩增仪（Bio-Rad公司），Rotor-Gene 6000荧光定量 PCR 仪（Corbett公司），NanoDrop ND-2000分光光度计（Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 分离血清，用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取细胞游离DNA，NanoDrop ND-2000（超微量紫外分光光度仪上）检测DNA浓度及质量，要求光密度（OD）值（A260／A280）约为1.80～2.00，调整DNA浓度至10ng／μL。1.3.2 甲基化修饰 取上述DNA样本1ng，使用EZ DNA Methylation Gold Kit，按照说明书进行甲基化修饰。

1.3.3 引物设计 使用软件MethyPrimer设计引物，引物由上海吉玛制药技术有限公司合成。上游引物序列：5′-GGC GGT TGT TTG GAT TTG GGT T-3′，长度83bp，下游引物序列：5′-AAC ACG CCC TAC AAC AAC ATC TA-3′），长度83bp。

1.3.4 构建标准品 以 CpGenome Universal Methylated DNA（Millipore公司）作为100%甲基化的标准品，以100%非甲基化的健康人外周血DNA作为稀释剂，按不同比例搭配制成100% 、80%、60%、40%、20% 、10%、5%、1% 和 0 甲 基 化 程度的标准品，进行下一步的HRM曲线分析后得到标准曲线图。

1.3.5 MS-HRM测定 AKAP12启动子区甲基化扩增条件：预变性95℃5min，1个循环；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环，72℃5min延伸。使用PCR基因扩增仪扩增后，使用Rotor-Gene 6000进行高分辨率熔解曲线分析：样本经95℃2min，40℃2min预处理后，溶解时温度由76℃逐渐升高到88℃，每升高0.1℃需记录数值。获得 MS-HRM曲线图。待测标本需按照标准曲线上来测定其甲基化程度。

1.3.6 重复性检测 HRM方法检测重复性，采用取100%～0系列浓度的甲基化标准品重复检测2次，观察HRM曲线的相符程度。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行分析。计数资料以率（%）表示，AKAP12甲基化与病理参数比较，采用χ2检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MS-HRM标准曲线和重复性试验结果 分别将100%～0甲基化标准品基因扩增后进行HRM曲线检测，得到标准曲线图（图1）。待测标本的甲基化程度可参照100%～0系列浓度曲线中的相应曲线得出。同时，取100%～0甲基化标准品重复检测2次，得到的HRM曲线形状基本一致。

图1 MS-HRM法检测AKAP12基因甲基化程度的标准曲线图

2.2 MS-HRM检测AKAP12基因甲基化结果 从60例肺癌患者标本中检出34例（56.7%）AKAP12基因甲基化，其中，18例（52.9%）甲基化程度为1%～20%，14例（41.2%）为20%～60%，2例（5.88%）为60%～100%。

2.3 外周血AKAP 12基因甲基化与患者病理参数相关性检测 外周血中AKAP12基因甲基化水平在不同患者年龄和性别中比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而与肺癌的病理分期和分化程度比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 外周血AKAP12基因甲基化与肺癌患者关系

续表2 外周血AKAP12基因甲基化与肺癌患者关系

3 讨 论

近年来，关于体液中（血液、尿液、唾液及痰液等）细胞游离DNA的研究得到越来越多的关注。目前，认为肿瘤患者血液游离DNA主要来自凋亡细胞、肿瘤细胞以及淋巴细胞等，其中来源于凋亡细胞或坏死肿瘤细胞占较大比例（可高达93%）［8］。目前，国内外研究发现，体液游离DNA抑癌基因启动子CpG岛的异常高甲基化常常与肿瘤的发生、发展、预后以及复发等密切相关［9－11］。因此，体液标本中游离DNA甲基化水平可以为肿瘤早期筛查、早期诊断、转移及复发监测的一项重要指标，并能有助于早期发现有癌变倾向的细胞［12］。

AKAP12能够锚定一些重要信号蛋白，主要参与蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）复合物的形成，细胞骨架的重塑，β2肾上腺素受体复合物的调节及细胞凋亡等过程［2－3］。国内外研究发现，AKAP12在多种肿瘤中表达下降或缺失，可见于黑色素瘤、乳腺癌、视网膜母细胞瘤、食管腺癌、骨肉瘤、前列腺癌、胃癌、血液系统恶性肿瘤等［4－5］，提示 AKAP12可能为一种潜在的抑癌基因。此外，研究还发现AKAP12具有抑制肿瘤发生与转移，阻滞细胞周期以及促进细胞凋亡等作用［13－14］。目前，已经在多种肿瘤中发现AKAP12的高甲基化现象，Choi等［15］在胃癌组织和细胞株中发现高甲基化（56%）的存在，且与AKAP12表达缺失相对应。

本研究通过建立MS-HRM，检测50例肺癌患者外周血游离DNA中AKAP12启动子的甲基化状况，以此探讨肺癌患者外周血AKAP12高甲基化与肿瘤发生的关系。MS-HRM作为一种先进的技术手段，具有较高的灵敏度、特异性和重复性，利用此方法可以检测出最低1%的基因甲基化，这大大提高了肺癌的检出率，有利于进行高危人群的筛选，早期诊断，转移和复发的监测。本研究结果显示，34例（56.7%）肺癌患者标本中检出AKAP12基因甲基化，其中，18例（52.9%）甲基化程度为1%～20%，14例（41.2%）为20%～60%，2例（5.88%）为60%～100%。随后，笔者研究了肺癌患者外周血AKAP12基因甲基化水平与病理参数的相关性，研究表明患者年龄、性别与AKAP12甲基化水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而肺癌的病理分期和分化程度与AKAP12甲基化水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示AKAP12的甲基化与肺癌的进展有关，可以用来评估肺癌的分期和恶性程度。

综上所述，肿瘤中抑癌基因的高甲基化现象普遍存在，单个基因的甲基化往往不能完整反映肿瘤的基本情况，而进一步研究表明每种抑癌基因都存在不同的启动子甲基化模式，因此，对于AKAP12基因启动子甲基化研究为临床上多方面、多角度监测肿瘤提供了一个重要指标。

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