老年男性缺血性脑卒中患者炎性因子血清学水平变化与预后的关系

刘 润，周 农

近年来随着人口的老龄化，脑血管病的发病率呈上升趋势。缺血性脑卒中即为广义的脑梗死，其发病率占脑卒中患者的60%～70%，主要包括脑血栓形成和脑栓塞[1]。流行病学调查显示，高敏C反应蛋白(hs-CRP)水平升高者发生急性脑血管病的几率是正常健康人的2倍；不同时期性别差异所表现出的卒中风险差异主要与雌激素(E2)有关，外源性E2对缺血性脑损伤的动物模型有保护作用；在动物研究中还发现白介素6(IL-6)与动物脑损伤病情严重程度有关[2-9]。然而E2、IL-6和hs-CRP对人类疾病的影响的机制研究目前还尚不成熟，因此本研究选取了IL-6、hs-CRP和E2作为研究指标，探讨了其在老年男性缺血性脑卒中患者中的动态变化和机制，并通过NIHSS评分研究患者的神经功能损害与前三者的关系，揭示对早期预后的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2011年4月—2012年6月我院神经内科老年男性缺血性脑卒中患者为研究对象(病例组)，所有抽选的病例年龄60～78岁，平均年龄为(66.3±4.6)岁，均符合第四届全国脑血管病学术会议制定的缺血性脑卒中诊断标准[10]，且为首次发病，并经颅脑CT或MRI检查证实。排除标准：既往有明确的基础疾病史患者，如有冠心病、糖尿病、慢性感染性疾病、结缔组织疾病、肝肾功能异常、恶性肿瘤、严重营养不良、甲状腺功能低下、癫痫、周围血管病等；近期有感染性疾病未愈、创伤或服用激素类药物史，治疗中出现明显并发症需抗炎治疗干预处理。选取同期体检合格的健康男性进行匹配(对照组)，匹配条件为年龄相差不超过2岁，近期无创伤或服用激素类药物史。总共纳入38名，年龄60～76岁，平均年龄为(65.8±4.8)岁。病例组与对照组患者年龄相比差异无统计学意义(t=0.94，P>0.05)。

1.2 研究方法

1.2.1 检测指标与方法 采用放射免疫分析技术测定血清中E2值。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定标本中IL-6水平。采用终点投射比浊法测定血清hs-CRP水平。

1.2.2 标本采集与准备 所有研究对象均于早晨空腹时采集静脉血3 ml，置于试管中，经3 000 r/min离心10 min，分离血清后转入Eppendorf管，低温(-20 ℃)保存待检测。病例组患者分别于缺血性脑卒中急性期(发病后第1天、第3天、第7天)及恢复期(发病后第14天、第30天)固定时间段内采集血液样本进行检验。同时采用常规方法检测患者的总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、三酰甘油、血小板、白细胞。对照组标本的采集方法同上，仅于第1天采集。

1.2.3 神经系统评分 对所有入选的缺血性脑卒中患者在治疗过程中的意识状态采用了格拉斯哥昏迷评分(GCS)量表评定意识状态。对所有入选的缺血性脑卒中患者在治疗过程中的神经功能状况采用美国国立卫生研究院脑卒中量表(NIHSS)评定神经功能状况。病例组患者分别于缺血性脑卒中急性期及恢复期固定时间段进行相关量表测定。由3人同时对患者评分，取平均分以提高准确性。

1.3 试剂和仪器 (1)IL-6试剂盒由上海恒远生物科技公司提供；(2)hs-CRP试剂盒购自四川省迈克科技有限责任公司；(3)E2试剂盒由中国科学院原子能研究所提供(使用FT-630G微机多探头γ计数器)；(4)离心机为LDZ5-2，由北京离心机厂提供；(5)酶标检测仪为AD450，由美国贝克曼-库尔特公司提供；(6)洗板机为MW960，由美国贝克曼-库尔特公司提供；(7)恒温水浴箱为WS27，由SHELLAB-US公司提供。

2 结果

2.1 病例组急性期指标变化及与对照组比较 交互效应分析结果显示时间和不同组别之间不存在交互作用(F=1.79，P=0.08)；组别效应有统计学意义(F=7.13，P<0.01)，病例组IL-6以及hs-CRP水平高于对照组(t=15.83，P<0.01)和(t=16.40，P<0.01)，E2水平低于对照组(t=39.76，P<0.01)；时间效应有统计学意义(F=13.80，P<0.01)。见表1。

2.2 病例组恢复期指标变化及与对照组比较 交互效应分析结果显示时间和不同组别之间不存在交互作用(F=1.66，P=0.20)；组别效应无统计学意义(F=1.17，P=0.24)，时间效应无统计学意义(F=0.74，P=0.46)。见表2。

2.3 相关性分析

2.3.1 患者急性期IL-6、E2以及hs-CRP水平与其他指标相关性分析 采用Pearson线性相关分析法，结果显示IL-6分别与白细胞计数、GCS评分、NIHSS评分呈相关；E2分别与白细胞计数、GCS评分、NIHSS评分呈相关；hs-CRP分别与白细胞计数、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、GCS评分、NIHSS评分呈相关。见表3。

2.3.2 患者恢复期IL-6、E2以及hs-CRP水平与其他指标相关性分析 采用Pearson线性相关分析法，结果显示IL-6、E2、hs-CRP分别与NIHSS评分呈相关。见表4。

3 讨论

缺血性脑卒中是指突然发生的脑组织局部供血动脉血流灌注减少或血流完全中断，停止供血、供氧、供糖等，使该局部脑组织崩解破坏，导致卒中后脑损伤，机体发生疾病后会启动一系列机制来对抗损伤。因次，不论是损伤还是修复，细胞因子都不可避免地参与疾病的过程，必然会带来部分细胞因子血清学水平变化，本研究同样发现在老年男性患者发病后细胞因子会产生血清学水平的差异，与病情发展以及预后有一定关系，现做进一步探讨。

表1 两组患者急性期血清IL-6、E2、hs-CRP水平

注：IL-6=白介素6，E2=雌激素，hs-CRP=高敏C反应蛋白

表2 两组患者恢复期血清IL-6、E2、hs-CRP水平

表3 患者急性期血清IL-6、E2、hs-CRP与其他指标的关系

Table3 The correlation between IL-6,E2,hs-CRP and the other indicators in acute onset phase

指标IL-6r值 P值E2r值 P值hs-CRPr值 P值年龄0 0920 2390 0880 1940 0960 267血小板计数0 0310 6710 0280 5590 0280 556白细胞计数0 4040 0220 3980 0290 1780 037总胆固醇0 0230 5100 0520 5350 2760 062三酰甘油0 0620 3240 0790 4960 320 042低密度脂蛋白0 090 2250 0950 2660 3130 048高密度脂蛋白-0 0710 438-0 0720 442-0 5850 026GCS评分-0 4050 0450 3850 039-0 4280 017NIHSS评分0 8420 016-0 3580 0440 6140 012

注：GCS=格拉斯哥昏迷评分，NIHSS=美国国立卫生院脑卒中量表

表4 患者恢复期血清IL-6、E2、hs-CRP与其他指标的关系

Table4 The correlation between IL-6,E2,hs-CRP and the other indicators in recovery phase

指标IL-6r值 P值E2r值 P值hs-CRPr值 P值年龄0 0980 2710 1050 1780 0850 342血小板计数0 0420 6090 0650 5260 0210 732白细胞计数0 0960 2770 0560 5910 1020 182总胆固醇0 1090 1640 0580 560 0810 304三酰甘油0 0580 5820 0610 5340 0340 673低密度脂蛋白0 1120 1550 0870 2010 0810 351高密度脂蛋白-0 0680 542-0 0620 532-0 0770 476GCS评分-0 1330 1250 0140 972-0 0530 583NIHSS评分0 7250 013-0 3770 0370 7410 011

3.1 脑梗死患者血清IL-6的动态变化与NIHSS关系 IL-6是一种急性反应蛋白，属于白介素家族。有研究表明患者在卒中后6～24 h内体内白细胞即发生浸润，1～2 d内中性粒细胞在血清中水平达到最高[11]。通过动物模型研究发现，球囊损伤动脉几小时后，中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞在损伤部位的动脉外膜处大量聚集[12]。本研究的病例组IL-6水平在第3天时达到最高，在第7天降低，时间效应分析显示有差异，上述结果提示脑卒中后脑损伤与IL-6有关。患者IL-6水平与年龄、血小板计数、总胆固醇等无相关性，但与白细胞计数、GCS评分、NIHSS评分呈相关，这说明IL-6参与炎性反应。这与Emsley等[13]的研究结论一致。这可能是因为在应激状态下机体会释放出信号分子，并通过细胞信号传导进而激活免疫系统，如T细胞、NK细胞、巨噬细胞等，并逐渐向病灶处释放炎性因子。有动物实验发现在大脑中动脉闭塞(MCAO)中，在中性粒细胞浸润受到抑制时梗死灶体积明显变小[14]，在耗竭中性粒细胞或抑制黏附分子后，脑缺血与神经功能缺损显著缓解。本次研究发现在发病后血清IL-6水平较高的患者NIHSS评分较高，提示脑损伤及神经功能障碍严重，在第14天、第30天时NIHSS评分同样较高，神经功能障碍较严重，该结论与动物实验基本相符，说明IL-6对急性期脑损伤严重程度有一定提示作用，对早期预后具有不利影响。但另一方面，炎性反应对于恢复期神经恢复可能有益，Dihne等[15]发现，局灶性脑缺血患者在3～7 d IL-6高水平表达区神经元数量最多。由于神经功能障碍是整个神经系统损伤的宏观表现，包括神经元的损伤和神经网络结构的破坏，不能由NIHSS评分推测神经组织的坏死或凋亡具体程度和神经网络结构的缺损度,因此IL-6与后期的关系需要进一步试验研究。

3.2 脑梗死患者血清hs-CRP的动态变化与NIHSS关系 hs-CRP是在感染和组织损伤时血浆中快速升高的主要急性期蛋白之一。CRP是主要在肝脏内合成的一种急性反应时相蛋白[16-17]。目前认为动脉粥样硬化的进展和粥样斑块的分解破裂等均和炎性损伤有关，而其中hs-CRP与动脉粥样硬化发生的重要环节密切相关。本研究中病例组在急性期发病第3天时hs-CRP水平达到最高,发病后血清hs-CRP水平较高的患者NIHSS评分高，神经功能缺损严重，其原因为脑缺血后脑组织出现病理性改变，直接导致炎性递质IL-6的释放，促进了hs-CRP的合成。在第14天、第30天时NIHSS评分同样较高，通过对hs-CRP水平与神经功能缺损程度及预后进行相关分析发现：hs-CRP越高，预后差；hs-CRP越低，神经功能缺损程度较轻，预后好。这主要是因为hs-CRP水平的增高提高了神经系统血管凝血的几率。朴海等[18]发现缺血性脑卒中患者脑损伤面积随hs-CRP水平增加而呈递增趋势，神经功能缺损程度随hs-CRP水平增加而呈递增趋势，提示部分炎性因子对于卒中后早期神经恢复不利，间接支持本次研究。Fichtlscherer等[19]研究证实，血清中hs-CRP水平可用来判断急性缺血性脑卒中患者病情的轻重及预后。Verma等[20]进一步研究发现，在培养的内皮细胞中增加hs-CRP可减少NO的合成。hs-CRP在缺血性脑卒中的形成及进展中起关键性作用，虽然现在还没有根本性药物能够降低hs-CRP在血清中的水平，但作为一种炎性反应的标志物在一定程度上能够反映出炎性反应的轻重，可为缺血性脑卒中预防、诊断、治疗及预后提供有价值的信息。由此可见，hs-CRP水平与脑血管病的严重程度密切相关，是否可以通过应用抑制其增高的药物起到稳定粥样硬化斑块及减少严重脑血管病事件的发生是值得进一步研究的问题。

3.3 脑梗死患者血清E2的动态变化与NIHSS关系 病例组在急性期、恢复期E2水平先降低后升高，E2在与以下单因素如年龄、血小板计数、总胆固醇等无相关性，但E2和NIHSS呈负相关，此结果提示E2与男性缺血性脑卒中有利预后密切相关，E2对男性缺血性脑卒中恢复有积极意义。动物实验研究发现，大鼠的MCAO模型中，雌性高血压大鼠脑组织损害体积较雄性及未经E2治疗的卵巢切除大鼠脑组织小[3-4]，且皮质和海马区神经元受损较轻[5]。Solum等[21]研究结果提示大鼠在发育期E2影响海马神经元的生长、分化和生理功能。E2对血管内皮也具有保护作用，国内杨卫民等[22]在E2的大鼠实验研究中表明脑缺血2 h后，皮质、海马及基底核区即出现 Bax、p53蛋白的表达，24 h达到高峰，用E2预处理后可降低其表达，同时诱导凋亡抑制基因 Bcl2的表达明显，其脑保护作用的剂量依赖与E2对其受体的封闭有关，一定程度上证实了E2可能通过与受体相结合，提高其与特定靶基因相结合的能力，从而诱导或抑制靶细胞特异基因的转录。因此，E2对脑损伤具有保护作用得到大多数动物实验的支持。从本次研究观察中发现，在男性患者缺血性脑卒中发病后，E2水平均有不同程度的下降，E2水平下降程度较小患者的NIHSS评分较低，神经功能损伤相对较轻，预后较好，这种现象可以用动物实验研究结果来解释。结合前面部分对IL-6、hs-CRP的探讨，E2在男性缺血性脑卒中患者恢复中的积极作用可能是通过影响白细胞与炎性反应的过程来完成的。本次研究中我们发现男性缺血性脑卒中患者发病后E2水平下降现象，这种改变是E2参与神经修复被消耗还是单纯病理性的减少、变化的分子生物学机制、减少对于神经系统和疾病预后的影响以及与其他细胞因子的关系目前仍不十分清楚，仍然是值得研究的问题，需要今后进一步探讨。

3.4 男性缺血性脑卒中患者血清IL-6、E2、hs-CRP水平的动态变化及关系 缺血性脑卒中后，由于脑组织缺血坏死，不仅产生大量抗原刺激免疫系统，而且有大量的炎性细胞浸润和激活，引起强烈的免疫应答过程，使T淋巴细胞、B淋巴细胞和单核巨噬细胞等被激活，产生大量的IL-6，并参与缺血性脑卒中的病理变化过程。在动脉粥样硬化过程中，巨噬细胞产生的IL-6等细胞因子诱导hs-CRP产生，所以hs-CRP在脑卒中患者病程中的变化与IL-6类似。一般认为，应激或损伤后早期6～12 h内有一些细胞因子存在短期分泌高峰，然后逐步下降，如IL-6等，这是由于短时间内脑细胞对脑组织缺血引起的瞬时应激反应[23]。但本研究发现老年患者在发病第3天细胞因子水平存在迟发的另一高峰。这可能由于老年患者代谢和生理功能下降、细胞膜表面受体数目减少或受体敏感性下降等诸多原因，导致免疫系统在损伤与应激时合成细胞因子上的迟后与合成能力的下降，引起某些细胞因子分泌高峰的延迟[24]。其次老年患者机体储备能力下降，这种高峰现象可能会因为机体储备能力不足而打折或延迟，另外，患者在发病后入院时间上不可能完全一致，因而也可能导致不能完全观察到6～12 h的分泌高峰。同时发病6～12 h检测难以整体保证时间的准确，误差大。在临床上，通过影像学比较发现，老年缺血性脑卒中患者脑水肿第一高峰常常在发病后第3天开始出现，而脑组织水肿与炎性反应、炎性细胞因子参与是密切相关的，间接提示老年患者存在细胞因子分泌高峰延迟[25]。本次研究中发现在男性缺血性脑卒中患者疾病过程中IL-6与hs-CRP呈早期先升高恢复期逐渐下降的变化规律，此种变化规律与病情的发展规律相一致，通过NIHSS及GCS相关性评价，提示IL-6与hs-CRP在早期脑损伤中的不利影响，与动物实验研究结果基本一致。而E2在该疾病过程中变化规律恰与前者相反，为早期急剧下降恢复期逐渐升高恢复正常的规律，有一定的反向相关性。从已有的动物实验中发现 E2能够抑制炎性因子[26]，在小鼠颈动脉损伤模型中雄性鼠血管内膜的形成大于雌性鼠[27-29]。进一步研究表明，通过注射E2维持其在血液中的生理水平，有利于减少雌雄鼠血管内膜的形成。患者发病后第1天、第3天、第7天的IL-6、E2、hs-CRP 水平与对照组有差异，而第14天、第30天与对照组比较无差异，也就是说发病第1天、第3天、第7天与发病第14天、第30天的IL-6、E2、hs-CRP 水平存在阶段性差异，第一个阶段机体细胞因子释放明显，机体处于应激反应的高水平时期。第一阶段IL-6、E2、hs-CRP与部分临床指标相关，与NIHSS评分相关，而第二阶段时与前述部分临床指标相关性降低，但仍与NIHSS评分相关，提示所研究的整个过程中IL-6、E2、hs-CRP 对NIHSS评分影响密切，明显影响预后。同时对其他细胞因子与生化指标也是有明显影响的，这种影响在机体应激反应强烈时尤为明显，共同影响疾病整个过程。本研究发现血清IL-6、hs-CRP与E2变化有一定的动态关系，推测存在相互影响机制，提示在E2对该疾病过程有一定的有利影响，其发挥作用的某些环节可能与既往动物实验所阐述的机制有关，临床可以通过调控E2水平来影响部分炎性细胞因子以减轻脑损伤。国外开展了E2对缺血性脑卒中患者的临床干预研究，发现在人体身上也有一定脑保护作用[30]。E2发挥对IL-6与hs-CRP的影响可能是其产生有利作用的环节之一，但在人体中详细机制及与其他细胞因子网络的关系和在其中所处的位置仍需要进一步研究和证实。

1 全国第四届脑血管病学术会议.各类脑血管疾病诊断要点[C].中华神经科杂志，1996，29(6):379.

2 么冬爱，刘汉兴，张晓琴，等.雌激素与脑梗塞[J].国外医学脑血管疾病分册，2000，8(1):6.

3 彭纲，英斌，李耀华.雌激素对雄性大鼠缺血性脑卒中的神经保护作用[J].伤残医学杂志，2003，11(4):1-5.

4 蔡圣云，肖林，邱俭，等.雌激素的神经保护作用[J].生命的化学，2001，21(2):129.

5 张立群，魏岗之.雌激素与心脑血管病关系的研究现状[J].中华医学杂志，2005，85(28):2012-2015.

6 周璘.雌激素的神经保护机制研究[J].国外医学妇幼保健分册，2003，14(4):208-210.

7 吴乐，陈文军.雌激素的神经保护作用及其机理[J].神经解剖学杂志，2005，21(1):95-96.

8 杨珉.雌激素对缺血性脑损伤的保护作用及机制[J].国外医学神经病学神经外科学分册，2004，31(5):451-453.

9 李国辉，付希久.雌激素与脑缺血[J].沈阳医学院学报，2003，5(4):265-266.

10 全国第四届脑血管病学术会议.脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准(1995)[J].中华神经科杂志，1996，29(6)：381.

11 Fassbender K，Rossol S，Kammer T，et al.Proinflammatory cytokines in serum of patients with acute cerebral ischemia:Kinetics of secretion and relation to the extent of brain damage and outcome of disease[J].J Neurol Sci，1994，122(3):135-139.

12 Rifai N，Ridker PM.High sensitivity C-reactiveprotein:A novel and promising maker of coronary heart disease[J].J CIin Chem，2001，47(3):403-411.

13 Emsley HC，Smith CJ，Grain CM.An early and sustained peripheral inflammation response in acute ischaemic stroke:Relationships with infection and atherosclerosis[J].J Neuroimmunol，2003，139(1/2):93-101.

14 Clark WM，Rinker LG，Lessov NS，et al.Lack interleukin-6 expression is not protective against focal centralnervous system ischemia[J].Stroke，2000，31(70):1715.

15 Dihne M，Block F.Focal ischemia induces transient expression of IL-6 in the substantia nigra pars reticulata[J].Brain Res，2001，889(1-2):165.

16 Yu h，Rifai N.Hight-sensitivity CRP and atherosclerosis from theory to clinic therapy[J].J CIin Biochem，2000，33(8):601-610.

17 Silvestri A，Vitae C，Ferretli F，et al.Plasma levels of inflammatory C-Neactive protein and interleukin-6 predict outcome in elderly patients with stroke[J].J Amgeriatr Soc，2004，52(9):1586-1587.

18 朴海，金永华.急性缺血性脑卒中患者血浆Lp-PLA2和hs-CRP水平及意义[J].哈尔滨医科大学学报，2012，46(3):266-268.

19 Fichtlscherer S，Rosenberger G，walter DH，et al.Elevated C-reactive protein levels and impaired endothelial vasoreactivity in patients with coronary artery disease[J].Circulation，2000，102(9):1000-1006.

20 Verma S，wang CH，Li SH，et al.A self-fulfilling prophecy:C-creative protein attenuates nitric oxide production and inhibits angiogenesis[J].Circulation，2002，106(8):913-919.

21 Solum DT，Handa RJ.Estrogen regulates the development of brain-derived neunotrophie factor mRNA and protein in the rat hippocampus [J].J Neurosci，2002，22(7):2650-2659.

22 杨卫民，周农，汪凯，等.雌激素对雄性大鼠缺血性脑损伤的神经保护作用及其可能机制[J].临床神经病学杂志，2005，18(4):250-253.

23 Szczudlik A，Dziedzic T，Bartus S，et al.Serum interleukin-6 predicts cortisol release in acute stroke patients[J].J Endocrinol Invest，2004，27(1):37-41.

24 Kriz J.Inflammation in ischemic brain injury:Timing is important[J].Crit Rev Neurobiol，2006，18(1/2):145-57.

25 Ayata C，Ropper AH.Ischaemic brain oedema[J].Journal of Clinical Neuroscience，2002，9(2):113-124.

26 Puder JJ，Freda PU，Goland RS，et al.Estrogen modulates the hypothalamic-pituitary-adrenal and inflammatory cytokine responses to endotoxin in women[J].J Clin Endocrinol Metab，2001，86(6):2403-2408.

27 Xing D，Miller A，Novak L.Estradiol and progestins differentially modulate leukocyte infiltration after vascular injury[J].Circulation，2004，109(2):234-241.

28 Miller AP，FengW，Xing D，et al.Estrogen modulates inflammatory mediator expression and neutrophil chemotaxis in injured arteries[J].Circulation，2004，110(12):1664-1669.

29 Miller AP，Xing D，Feng W，et al.Aged rats lose vasoprotective and anti-inflammatory actions of estrogen in injured arteries[J].Menopause，2007，14(2):251-260.

30 Viscoli CM,Brass LM,Kernan WN，et al.A clinical trial of estrogen-replacement therapy after ischemic stroke[J].New England Journal of Medicine，2001，345(17):1243-1249.