“脾肾相关”机理探讨补肾健脾方对脾肾两虚型 骨质疏松症大鼠外周血中OPG、RANKL、VIP、 MTL、GAS含量的影响❋

李鸿泓，于 峥，赵宏艳，易小烈，潘静华，刘 红，李 艳，王少君， 陈 曦，汤尔群，张立石，李岳泽，张方珍，鞠大宏△，刘梅洁△

(1.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700；2.石景山区中医医院， 北京 100041； 3.黔西县中心医院，江西 黔西 551500)

“脾肾相关”理论是中医学的重要理论之一，是中医认识疾病、诊治疾病的重要思维方法，该理论在骨质疏松症的防治过程中发挥着重要指导作用。既往课题组在建立骨质疏松症脾肾两虚型病证结合动物模型[1]的基础上，探讨了补肾健脾方对大鼠脾肾两虚型骨质疏松症的治疗作用[2]。此次，本研究将对补肾健脾方的作用机理作进一步的深入探讨，以期为阐明“脾肾相关”的科学内涵提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

选用健康雌性SPF级Wistar大鼠 86只，体质量200～220 g，由中国药品生物制品检定所提供(许可证编号SCXK(京)2009-0017)，在中日友好医院临床研究所动物室屏障系统饲养(实验动物室许可证号：SYXK(京)2010-0011)。

1.2 药物

己烯雌酚由合肥久联制药有限公司生产(批号20100120)，规格：每片1 mg，使用时用蒸馏水制成浓度为0.0046 mg/mL的混悬液，给药体积为1 mL/100 g体质量，给药剂量为0.046 mg/kg体质量。健脾方药采用四君子汤：人参9 g，茯苓9 g，白术9 g，甘草6 g，常规水煎制，含量为3.04 g生药/kg，给药浓度为0.304 g/ml。补肾方药采用龟鹿二仙汤：龟板胶9 g，鹿角胶6 g，人参9 g，枸杞9 g。常规水煎制含量为3.04 g生药/kg，给药浓度为0.304 g/ml。补肾健脾方药采用龟鹿二仙汤合四君子汤：龟板胶9 g，鹿角胶6 g，人参9 g，枸杞9 g，茯苓9 g，白术9 g，甘草6 g。常规水煎制，含量为5.26 g生药/kg，给药浓度为0.526 g/ml。大黄水煎液：川大黄水煎制，浓缩至200%。

1.3 试剂

戊巴比妥钠由美国Sigma公司生产(批号20090305)，大鼠VIP ELISA试剂盒：美国MBS公司(批号W09083651)，大鼠GAS ELISA试剂盒：美国MBS公司(批号W09083650)，大鼠MTL ELISA试剂盒：美国MBS公司(批号W15083696)，大鼠RANKL ELISA试剂盒：美国R&B公司(批号07081103)，大鼠OPG ELISA试剂盒：美国R&B公司(批号07081102)。

1.4 仪器

Wellwash 4 Mk2洗板机：美国Thermo公司，Multiskan Mk3酶标仪：美国Thermo公司， TDZ5-WS多管架自动平衡离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司，Osteocore3 Digital 2D 骨密度仪(双能X线)：法国Medilink公司，-80℃低温冰箱：美国 Thermo公司。

1.5 方法

1.5.1 动物分组、模型制作及处理 选用健康雌性Wistar大鼠86只，按随机数字表法分为空白对照组12只、假手术组12只、造模62只3组。所有大鼠适应性喂养1周后，造模组大鼠制作脾肾两虚型骨质疏松症模型[1]。假手术组大鼠只切除小块脂肪组织，不摘除卵巢。造模完成后，将造模组大鼠随机分成脾肾两虚模型组、己烯雌酚组、补肾组、健脾组及补肾健脾组。除脾肾两虚模型组大鼠外，其余大鼠分别给予己烯雌酚、龟鹿二仙汤、四君子汤及两者的合方，每日1次，连续6 d，休息1 d，再连续给药6 d，每周称重1次，据此调整给药量。同时，脾肾两虚模型组大鼠给予200%的大黄水煎液灌胃，每周2次，如此给药3个月。空白对照组、假手术组按同法灌服等体积蒸馏水。给药结束后，采用大鼠麻醉后股动脉取血法，所取全血静置1 h后，经2000 rmp离心10 min后取血清；取血后将各组大鼠处死取出左侧股骨，剔除骨骼表面附着的软组织，用生理盐水浸湿的纱布包裹，放于-80℃冰箱保存待测，用于骨密度(BMD)检测。

1.5.2 指标检测 BMD检测：检测前取出冰箱中冻存的大鼠股骨室温下复温。采用Osteocore3 Digital 2D 骨密度仪检测各组大鼠股骨的骨密度。

血管活性肠肽(VIP)、胃动素(MTL)、胃泌素(GAS)、骨保护素(OPG)、细胞核因子κB受体活化因子配基(RANKL)含量的测定：检测前取出冻存的大鼠血清在室温下复温。采用ELISA法，按照试剂盒所附说明书检测大鼠外周血血清中VIP、MTL、GAS、OPG、RANKL的含量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠股骨BMD的影响

表1显示，与假手术组比较，脾肾两虚模型组大鼠股骨BMD显著降低。与脾肾两虚模型组比较，补肾组、健脾组、补肾健脾组、己烯雌酚组大鼠股骨BMD均显著增高，但仍显著低于假手术组。与健脾组比较，补肾组及补肾健脾组的BMD均明显增高，且两者之间比较差异无统计学意义。

2.2 补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠外周血血清中OPG及RANKL含量的影响

表2显示，脾肾两虚模型组OPG含量较之假手术组显著降低。与脾肾两虚模型组比较，健脾组OPG含量差异无统计学意义；而己烯雌酚组、补肾组、补肾健脾组OPG含量均显著增高，但仍显著低于假手术组。与健脾组比较，补肾组和补肾健脾组OPG含量均明显增高，且补肾健脾组明显高于补肾组。

表1 各组大鼠股骨BMD的变化

注：与假手术组比较：*P<0.05，**P<0.01；与脾肾两虚模型组比较：△P<0.05,△△P<0.01；与健脾组比较：☆P<0.05，☆☆P<0.01；与补肾组比较：P<0.05，P<0.01(下同)

与假手术组比较，脾肾两虚模型组大鼠外周血血清中RANKL含量显著增高。与脾肾两虚模型组比较，己烯雌酚组、健脾组、补肾组、补肾健脾组RANKL含量均显著降低，但较之假手术组仍显著增高。与健脾组比较，补肾组和补肾健脾组RANKL含量均显著降低，且补肾健脾组明显低于补肾组。

表2 各组大鼠外周血血清中OPG及RANKL含量

2.3 补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠外周血血清中VIP含量的影响

表3显示，与假手术组比较，脾肾两虚模型组大鼠外周血血清中VIP含量显著增高。从各治疗组VIP含量来看，除己烯雌酚组外，健脾组、补肾组、补肾健脾组VIP含量均显著低于脾肾两虚模型组，但健脾组和补肾组仍明显高于假手术组，而补肾健脾组与假手术组比较差异无统计学意义。与补肾组比较，健脾组和补肾健脾组VIP含量明显降低，且两者之间比较差异无统计学意义。

表3 各组大鼠外周血血清中VIP含量

2.4 补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠外周血血清中MTL、GAS含量的影响

表4显示，脾肾两虚模型组大鼠外周血血清中MTL、GAS含量较之假手术组显著降低。与脾肾两虚模型组比较，健脾组和补肾健脾组MTL、GAS含量均显著增高，但己烯雌酚组和补肾组比较差异无统计学意义。健脾组和补肾健脾组MTL含量均显著高于补肾组，补肾健脾组GAS含量明显高于健脾组和补肾组。

表4 各组大鼠外周血血清中MTL及GAS含量

3 讨论

1988年邓铁涛在“略论五脏相关取代五行学说”的文章中明确提出“五脏相关学说”的概念[3]，而脾肾相关理论正是其提出的“五脏相关学说”的一个重要子系统。具体到骨质疏松症(OP)这一常见病、多发病来说，脾肾相关理论在其防治过程中也发挥着重要指导作用。《素问·五脏生成》曰：“肾之合骨也，其荣发也，其主脾也。”骨的生长、发育不仅直接取决于肾，还受到后天脾胃功能的影响。近年来，一些医家在补肾健脾这一治则的指导下，采用补肾健脾方药治疗骨质疏松症，普遍取得了较好的疗效[4]。如王照康[5]自拟补肾健脾密骨方，对老年骨质疏松患者疼痛及相关生化指标具有明显的改善作用。王惠礼[6]等观察了具有调补脾肾作用的院内自制剂骨康宁胶囊对原发性骨质疏松症的疗效，结果发现，在治疗后患者症状改善明显，骨密度随之增加。本课题组以往的研究也证实[2]，补肾健脾方能明显提高脾肾两虚型骨质疏松大鼠的TBV%。本研究结果亦表明，经补肾健脾方治疗后，脾肾两虚型骨质疏松大鼠的BMD明显增高，说明补肾健脾方对其有明显的治疗作用。而补肾健脾方治疗骨质疏松症的机理何在？这是本研究深入探讨的关键问题。

OPG/RANKL在破骨细胞生成、分化、发育、成熟、激活过程中起决定性作用，是非常重要的破骨细胞分化调节信号因子。Yasuda[7]在研究发现，OPG基因敲除小鼠皮质骨和骨小梁减少，易出现严重的骨质疏松症。 Shimizu-Ishiura等[8]则研究了OVX小鼠，发现给予OPG的OVX小鼠骨小梁增加明显，而未给予OPG的OVX小鼠骨小梁减少，说明OPG可以抑制骨吸收而减少骨量丢失。RANKL是能够直接刺激破骨细胞发育和使之激活的惟一细胞因子，它与破骨细胞表面的RANK相结合，强有力地促进破骨细胞的生成、分化和成熟，并能增强破骨细胞运动能力；同时还可以抑制破骨细胞的凋亡，延长其存活时间[9，10]。

VIP及GAS、MTL均是衡量脾虚证的重要指标[11-12]。如黄学宽等[13]观察了具有益气健脾、行气消食作用的六味和中散对脾虚模型大鼠胃肠激素的影响。研究发现，脾虚模型大鼠VIP水平显著增高，GAS、MTL水平比正常对照组显著降低；经六味和中散治疗后上述指标发生逆转。近年来有研究表明，VIP与骨吸收密切相关[14，15]。如Perssona[16]研究发现，VIP能以时间、浓度依赖的方式刺激小鼠颅骨成骨细胞IL-6(白细胞介素6)mRNA的表达和蛋白的释放，而IL-6是一种强有力的骨吸收刺激因子，因此VIP能促进骨吸收。

本研究结果显示，与脾肾两虚模型组比较，补肾组、补肾健脾组OPG含量均显著增高，而健脾组与之比较差异无统计学意义；与健脾组比较，补肾组和补肾健脾组OPG含量均明显增高，且补肾健脾组明显高于补肾组。健脾组、补肾组、补肾健脾组RANKL、VIP含量均显著低于脾肾两虚模型组；与健脾组比较，补肾组RANKL含量降低更明显，且补肾健脾组又明显低于补肾组；与补肾组比较，健脾组和补肾健脾组VIP含量降低更为明显。与脾肾两虚模型组比较，健脾组和补肾健脾组MTL和GAS含量均显著增高，而补肾组与之比较差异无统计学意义，且补肾健脾组GAS含量明显高于健脾组和补肾组。

以上结果说明，健脾方、补肾方和补肾健脾方均能提高脾肾两虚型骨质疏松大鼠的BMD，其中补肾健脾方的效果最佳。补肾健脾方可通过上调OPG、MTL、GAS水平，并下调RANKL、VIP水平，从而达到对脾肾两虚型骨质疏松症的治疗作用。健脾方对MTL、GAS、VIP的调节作用强于补肾方，补肾方对OPG、RANKL的调节作用强于健脾方，而补肾健脾方对上述指标的调节作用均明显强于以上两方。这是补肾健脾方疗效优于补肾方和健脾方的机制之一，也进一步说明在骨质疏松症的发生和治疗过程中，中医的脾肾两脏是密切相关的。但必须指出的是，骨质疏松症作为一种病机涉及多脏器、病理包括多环节的复杂性疾病，补肾健脾法治疗骨质疏松症的作用机理必然是多方面的。本研究只是从一个角度进行了探讨，其他机理还有待进一步的深入研究。

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