效应面法优化石榴皮抑菌物的提取工艺

迟 雪，张丹丹

(青岛科技大学化工学院，青岛266042)

效应面法优化石榴皮抑菌物的提取工艺

迟 雪，张丹丹

(青岛科技大学化工学院，青岛266042)

采用单因素和效应面法对石榴皮抑菌物提取条件进行优化，并对结果进行验证。结果发现：最佳提取温度为59 ℃、时间为73 min、液料比为40∶1(mL/g)。实验证明石榴皮提取物对枯草杆菌具有很强的抑制作用，且所用工艺简单易行，说明效应面优化法建立的数学模型预测结果可靠。

抑菌；提取；石榴皮；效应面优化法

石榴皮(PericarpiumGranati)是石榴科石榴属植物石榴(PunicagranatumL.)的干燥果皮。具有镇痛、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、预防心脑血管疾病、抑菌[1-3]等功效。

目前多用正交法考察各实验条件对石榴皮抑菌能力的影响，采用效应面法的报道则较罕见。效应面法比正交法简化，试验精度高，可对未做过的试验进行预测[4-5]。因此，本实验采用效应面法对石榴皮中抑菌物质的提取条件进行优化，以期建立的数学模型可以准确预测不同实验条件下的抑菌能力，并确定最大抑菌能力下的提取条件。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

石榴皮(由新鲜石榴皮晒干后粉碎)，购于青岛京城百草厅大药房；牛肉膏，北京鸿润宝顺科技有限公司；蛋白胨，北京奥博星生物技术责任有限公司；琼脂，青岛正业试剂仪器有限公司；乙醇，烟台三和化学试剂有限公司；NaOH，天津博迪化工股份有限公司；NaCl，天津市瑞金特化学品有限公司；枯草芽胞杆菌，青岛科技大学生物实验室提供。

FA1004型电子天平，上海精密科学仪器分公司；RE-52型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；四两装高速中药粉碎机，山东青州精诚医药装备制造有限公司；KH-250DB型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；RXZ智能型人工气候箱，宁波市科技园新江南仪器有限公司；立式压力灭菌器，上海博迅实业有限公司；Sw-Cj-1F型单人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司。

1.2 抑菌直径的测定

将粉碎的石榴皮在不同条件下用乙醇超声提取，水浴干燥。用6 mm打孔器将培养皿中含有细菌的培养基打孔，将石榴皮提取物稀释至相同体积，用移液枪吸取80 μL加至各孔中。37 ℃恒温培养24 h，测抑菌直径，发现与汝绍刚等[6]的研究结果一致，抑菌直径越大，抑菌能力越强。

1.3 石榴皮粗提物的提取

1.3.1 单因素实验

称取石榴皮2.0 g，用超声波提取法，考察不同液料比、温度、提取时间对抑菌能力的影响。

1.3.2 星点实验

在单因素基础上，进行三因素五水平实验，并通过Statistica 6.0软件进行优化，确定最佳提取条件。

1.3.3 验证实验

根据模型确定最佳提取条件，在该相同条件下分别进行3次提取及抑菌实验，测定抑菌直径以验证抑菌能力的稳定性。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 液料比对抑菌结果的影响

称取石榴皮2.0 g，采用体积分数60%乙醇，提取时间和温度各组相同，进行平行的4组实验。液料比(mL/g)分别设为20∶1、30∶1、40∶1和50∶1，抑菌结果如图1所示。

图1 液料比对抑菌直径的影响Fig.1 Effects of raw liquid to solid on different inhibition diameters

从图1可以看出:液料比为40∶1(mL/g)时，石榴皮粗提物的抑菌能力最大。可能是由于液料比小于40∶1(mL/g)时石榴皮中有效成分没有被完全提取出来，所以抑菌能力会随着液料比的增加而增强；当超过40∶1(mL/g)时提取出来的有效成分趋于稳定，但因为溶液体积的增加导致过滤及旋干的时间增加而使一些不稳定的成分有少量降解继而导致抑菌能力降低。

2.1.2 温度对抑菌结果的影响

称取石榴皮2.0 g，液料比为40∶1(mL/g)，乙醇浓度60%，提取时间同上，在温度分别为50、60、70和80 ℃时进行提取，抑菌结果如图2所示。

图2 提取温度对抑菌直径的影响Fig.2 Effects of different extraction temperatures on inhibition diameters

从图2可以看出:温度为60 ℃时，石榴皮粗提物抑菌能力最大。这可能是由于温度越高，溶剂分子运动速度越快，促进了有效成分的溶解，然而温度过高会破坏药物中的有效成分而导致抑菌能力下降。

2.1.3 提取时间对抑菌结果的影响

称取石榴皮2.0 g，液料比为40∶1(mL/g)，乙醇浓度60%，提取温度为60 ℃，分别提取45、60、75和90 min，抑菌结果如图3所示。

图3 提取时间对抑菌直径的影响Fig.3 Effects of extraction time on different inhibition diameters

从图3可以看出:提取时间为75 min时，石榴皮粗提物抑菌能力最大。抑菌能力随时间的增加呈现先增强后减弱的趋势，这可能是由于超声时间越长，细胞破坏越完全，有效成分溶出越多，但超过一定时间后有效成分被破坏的量超过溶出的量，从而导致了抑菌能力下降。

2.2 以效应面法实验设计优化因素和条件

2.2.1 效应面法的实验设计

在单因素实验的基础上，对液料比(X1)、温度(X2)，时间(X3)进行三因素五水平的星点实验，用Statistica6.0软件对实验数据进行统计分析，星点设计因素水平见表1[7]。

表1 星点设计的因素和水平表Table 1 Variables and codes of central composite design

2.2.2 效应面法实验设计的优化结果与分析

效应面法实验的结果见表2。分别用二项式拟合和线性拟合对表2的实验数据进行处理。经比较发现二项式拟合所得的r值相对于线性拟合有了较大幅度的提高，因此，选择二项式拟合模型处理数据。

表2 星点设计实验结果Table 2 Results of experiment designed by central composite design test

表3 二次多项式非线性估计的结果Table 3 Results of binomial model fitting

2.3 响应面的优化和预测

利用Statistica6.0软件分别绘制各因素的三维效应面(图4、图5和图6)。

图4 X1和X2与抑菌直径的二维等高线图Fig.4 X1, X2 and inhibition diameters of contour plot

图5 X1和X3与抑菌直径的二维等高线图Fig.5 X1, X3 and inhibition diameters of contour plot

图6 X2和X3与抑菌直径的二维等高线图Fig.6 X2, X3 and inhibition diameters of contour plot

二维等高线图中心的最小圈是最佳提取范围，综合3个等高线图，可以看出提取条件的最佳范围：X1液料比(mL/g)为(37∶1～41∶1)；X2温度为(57.2～60.8) ℃；X3时间为(71.2～75.1) min。

2.4 优选工艺的验证

根据效应面法的最佳提取工艺，在液料比为40∶1(mL/g)、温度59 ℃、时间73 min条件下提取，抑菌结果见表4。

表4 验证实验表Table 4 Verification form of experimental results

由表4可知：抑菌直径的实际平均值为2.80 cm，和预测值2.83 cm基本吻合，说明效应面法的提取工艺是比较可靠稳定的，对未做的实验条件具有较好的预测性。本实验最佳工艺条件下的抑菌直径为2.80 cm，明显高于孔阳等[1]的最大抑菌直径2.10 cm，说明效应面法具有一定的优势。

3 结 论

通过单因素和效应面优化法优化了石榴皮抑菌成分的提取条件，主要考察了液料比、温度、时间对抑菌能力的影响。得出最佳提取条件为液料比40∶1(mL/g)、温度59 ℃、时间73 min。发现最佳条件下验证实验的抑菌直径与预测值基本吻合，说明本方法具有较好的预测性。

[1] 孔阳，马养民，李彦军，等.石榴皮粗提物抗菌活性的研究[J].安徽农业科学，2010,38(5):8995-8897.

[2] 杜欣，叶胜英.石榴叶和石榴皮药理活性研究进展[J].天津药学，2007，19(2):64-66.

[3] Negi S,Jayaprakasha K.Antioxidant and antibacterial activities ofPunicagranatumpeel extracts[J].Journal of Food Science,2003,68(4):1474-1477.

[4] 吴伟，崔光华.星点设计-效应面优化法及其在药学中的应用[J].国外医学药学分册，2000，27(5):292-298.

[5] 邱影，朱玲，孙晓英.星点设计-效应面优化法与正交设计和均匀设计及其在药剂研究中的应用[J].海峡药学，2011，23(2):18-20.

[6] 汝绍刚，崔波，迟玉霞，等.提取方法和溶剂对石榴皮中抑菌成分提取的影响[J].化学与生物工程，2011，28(12):43-45.

[7] Iskandarani B,Clair H,Patel P,et al.Simultaneous optimization of capsule and tablet formulation using response surface methodology[J].Drug Development and Industrial Pharmacy,1993,19(16):2089-2101.

(责任编辑 周晓薇)

Extraction of antimicrobials from pomegranate peel optimized byresponse surface methodology

CHI Xue,ZHANG Dandan

(College of Chemical Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China)

The extraction condition of pomegranate bacteriostatic materials was optimized by single factor test and response surface methodology.The optimum conditions were found as follows:the liquid to solid ratio 40∶1,extraction time 73 min,temperature 59 ℃.The result showed that the pomegranate extracts had strong antimicrobial effects onBacillussubtilis.The extraction method was simple,and the model established by response surface methodology could provide predictive accuracy.

antimicrobial;extraction;pomegranate peel;response surface methodology

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.02.007

2013-05-14

山东省自然科学基金(ZR2012HL48)

迟 雪(1988—)，女，黑龙江齐齐哈尔人，硕士研究生，研究方向：中药活性成分的提取与活性研究及新药开发；张丹丹(联系人)，副教授，E-mail:312685423@qq.com

R284.2

A

1672-3678(2014)02-0033-05