利用美拉德反应降低再造烟叶中的还原糖

高徐梅，李新生，严新龙，王 军*

1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京市海淀区清华东路17号 100083

2.上海烟草集团太仓海烟烟草薄片有限公司，江苏省太仓港口开发区东方东路19号 215433

再造烟叶又名重组烟叶或烟草薄片，已广泛用作卷烟原料［1-2］，对降低卷烟焦油量、改善填充能力和降低成本等都具有重要作用［3］。再造烟叶糖含量对产品品质具有重要影响，糖含量的高低与再造烟叶的吸味、颜色以及焦油量关系密切［4］。如果再造烟叶糖含量偏高、糖碱比不协调，就会影响产品品质。目前大部分企业采取造纸法生产再造烟叶，其工艺是用水浸泡原料后，将可溶性物质与不溶性物质萃取分离，不溶性物质的纤维疏解后磨浆，再制成再造烟叶纸基；而可溶性物质萃取液经过浓缩并加入香精香料等配料得到涂布液，将其均匀涂布于基片上，经烘干后分切即得成品［5］。美拉德反应是非酶促褐变的一种，其过程复杂，受氨基酸及糖种类影响，并且与反应时的水分、pH、反应温度和时间、金属离子等有关［6-7］。因此，利用再造烟叶生产过程中减压浓缩、涂布烘烤等步骤中温度较高、作用时间较长、水分活度适宜等有利于美拉德反应的条件，通过外加氨基化合物，促进再造烟叶中的还原糖在生产过程中进一步发生美拉德反应，实现降低再造烟叶中还原糖含量的目的。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

基片、烟梗、烟末、烟片（江苏太仓海烟烟草薄片有限公司提供）；0.45 μm 纤维素膜（北京蓝弋化工产品有限责任公司）。

氯化铁（FeCl3）、碳酸钾（K2CO3）（AR，北京化工厂）；甲醇、乙腈（色谱纯，百灵威科技有限公司）；甘氨酸、赖氨酸、脯氨酸（食品级，北京鸿瑞嘉盛商贸有限公司）；葡萄糖（＞99.5%）、果糖（＞99%）（Sigma-Aldrich公司）。

Agilent 1260 型高效液相色谱仪、Agilent 1260 型蒸发光散射检测器（美国Agilent 公司）；RE-53AA 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；Milli-Q50 超纯水仪（美国Millipore 公司）；ASE-12 固相萃取仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；FA1104B 电子天平（感量:0.0001 g，上海越平科学仪器有限公司）；DHG-9070A 电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；SHZ-88 型摇床（江苏太仓市实验设备厂）；TDL-5-A 台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；MA30 红外水分测定仪、PB-10 pH 计（德国Sartorius 公司）；Sep-Pak C18固相萃取小柱（100 mg/mL，Dikma 公司）。

1.2 方法

1.2.1 烟草萃取液的制备

称量1000 g 烟梗、500 g 烟末和500 g 烟片并混合，加入9000 mL 65 ℃水，于65 ℃水浴中保温30 min；过滤得到再造烟叶涂布用萃取液。经测定，萃取液中还原糖质量百分含量为2.1%。

1.2.2 再造烟叶的制备

取100 mL 萃取液，按萃取液中还原糖含量添加一定比例氨基酸，加入一定量0.01 mol/L FeCl3催化剂溶液和2.5 mol/L K2CO3溶液以调节pH，70 ℃水浴振荡2.5 h；再在70 ℃下减压浓缩（体系压力0.015 MPa）30 min 左右，所剩溶液体积约为原来的1/5；经测定此时萃取液密度约为1.22 g/cm3。将所得涂布液平均分为6 份涂于基片正反面（再造烟叶涂布率为38%），（165±2）℃下烘烤2 min 左右，得到模拟制备的再造烟叶。空白对照样品为相同条件下，烟草萃取液中未加入氨基酸等物质，直接经过浓缩、涂布、烘烤后制得的再造烟叶。

1.2.3 再造烟叶糖含量的测定

烟草中的还原糖主要包括葡萄糖和果糖［8］，这两种糖的总含量占还原糖含量的90%以上，可代表还原糖的总量，因此研究葡萄糖和果糖总量的降低程度可以衡量再造烟叶中还原糖含量的变化。

将再造烟叶剪成面积约为0.5～1.0 cm2的碎片，用蒸馏水浸泡40 min 后过滤，洗涤滤渣，将滤液定容至250 mL。将固相萃取小柱置于固相萃取仪中，用3 mL 甲醇以1 滴/s 的速度活化小柱，再用5 mL 超纯水以相同速度洗涤小柱，过程中始终保持小柱填料湿润。将上述滤液以1 滴/s 的速度通过活化好的固相萃取小柱进行纯化［9］，弃去最初的2 mL 滤液，收集随后的2 mL 液体，用纤维素膜过滤。滤液采用高效液相色谱法［10］测定其中果糖和葡萄糖的含量，并计算二者总量作为样品的还原糖含量。色谱条件为：

色谱柱：Inertsil NH2柱（4.6 mm×150 mm×5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：乙腈∶水=75∶25；流速：1 mL/min；进样量：10µL；检测器：蒸发光散射检测器（ELSD）；漂移管温度：80 ℃；载气：氮气。

1.2.4 再造烟叶感官评价

将制备的再造烟叶和空白对照样品（含水率均为12.5%左右）切丝，制成卷烟烟支，在温度（23±2）℃，相对湿度（60±5）%的恒温恒湿条件下平衡24 h 后，由上海烟草集团9 位评烟委员会委员对处理前后得到的再造烟叶进行感官评价。

2 结果与讨论

2.1 涂布后烘烤时间和温度的优化

实验先进行了再造烟叶涂布后的烘烤时间和温度条件的优化。工业生产中的再造烟叶含水率通常在12%左右［11-12］，根据高温、较低水分活度有利于美拉德反应的原理［13］，优化模拟实验的烘烤时间和温度。涂布后在不同温度和时间条件下进行烘烤，测定其含水率，优化最佳烘烤温度和时间。将涂布好的再造烟叶悬挂于电热恒温鼓风干燥箱中，使烘箱热风能够均匀地吹到涂布后的基片上，结果如表1 所示。表1 表明，当涂布后在165 ℃下烘烤2 min 时，再造烟叶含水率为12.13%，接近于在线生产要求，且烘烤温度和时间适中，可在该条件下研究美拉德反应对降低还原糖的影响。

表1 涂布后再造烟叶经不同温度和时间烘烤后的物理形态和含水率Tab.1 The physical states and moisture contents of coated reconstituted tobacco dried at different temperatures and durations

2.2 美拉德反应条件对降低再造烟叶还原糖含量的影响

2.2.1 不同氨基酸的反应效果

实验选取甘氨酸、脯氨酸和赖氨酸作为降低再造烟叶中还原糖含量的氨基酸。这3 种氨基酸各自具备不同的特点:甘氨酸结构比较简单，分子量小，反应时所需质量少；脯氨酸是烤烟原料中自身含量相对较高的氨基酸，含量较高时也不易产生异味；赖氨酸含有两个氨基，更容易发生美拉德反应，降低还原糖的效果会更好。在萃取液中按照还原糖∶氨基酸（摩尔比）=1∶1 的比例分别添加氨基酸，再加入0.01 mol/L FeCl3催化剂，使萃取液体系中Fe3+含量为0.01 mmol/L，用2.5 mol/L K2CO3调节pH 至6.2 左右；制备再造烟叶后，测定其中葡萄糖和果糖含量，两者的总量代表还原糖含量，结果如图1 所示。由图1 可以看出，添加各氨基酸后制备的再造烟叶中还原糖的含量均减少，其中，添加赖氨酸所制得的再造烟叶降糖效果最好，相对空白减少了23.5%；添加甘氨酸和脯氨酸的再造烟叶相对空白分别减少了17.9%和10.9%。

图1 还原糖和氨基酸的摩尔比为1∶1 时不同氨基酸处理的再造烟叶中还原糖含量Fig.1 The contents of reducing sugar in reconstituted tobacco treated with different amino acids at 1∶1 mole ratio of reducing sugar and amino acid

2.2.2 催化剂的选取及用量

Cammerer 等［14］研究指出铁离子等金属离子能不同程度地促进美拉德反应，且Fe3+催化能力比Fe2+强。本实验选取FeCl3为催化剂，以赖氨酸为反应物研究催化剂用量对降低再造烟叶还原糖含量的影响；以加入赖氨酸而不加催化剂的样品为空白，结果见图2。由图2可知，相对于空白样品，加入FeCl3催化剂后制备的再造烟叶中还原糖含量均有所降低，说明FeCl3对体系中的美拉德反应具有催化作用。当萃取液体系中的FeCl3浓度，即Fe3+的浓度为0.01 mmol/L 时，再造烟叶中还原糖含量最少，降糖效果最好，相对空白降低了9.56%。

图2 FeCl3用量对降低再造烟叶中还原糖含量的影响Fig.2 The effects of FeCl3catalyst dosage on reducing sugar content in reconstituted tobacco

2.2.3 不同pH 的影响

经测定，1.2.1 节所述烟草萃取液的pH 约为4.9，呈酸性。但美拉德反应在中性或碱性条件下更易发生［6］。实验研究了不同pH 对反应的影响，并选用K2CO3溶液调节反应体系的pH。在萃取液中分别加入氨基酸，使还原糖与氨基酸的摩尔比为1∶1，再加入FeCl3催化剂使体系中Fe3+含量为0.01 mmol/L，用K2CO3调节体系的pH。还原糖降低效果见图3。由图3 可以看出，随反应体系pH 逐渐增大，再造烟叶中还原糖含量逐渐降低。

不同pH 条件下，再造烟叶还原糖含量相对于空白样品的降低率如表2 所示。由表2 可知，pH=8 时所制备的再造烟叶中还原糖相对于空白样品减少了28%以上，降糖效果显著。说明调节后的萃取液pH 越大，降糖效果越好。但是，调节后萃取液的pH 过高，会导致浓缩涂布后制备的再造烟叶烟气酸性成分含量降低，刺激性增加，品质下降。经过实验优化，用2.5 mol/L K2CO3调节萃取液的pH 至6.2 左右较适合，制备的再造烟叶降糖效果和感官评价结果良好。

图3 不同反应体系pH 对再造烟叶降糖效果的影响Fig.3 The effects of pH on reducing sugar content in reconstituted tobacco

表2 不同pH 条件下反应后再造烟叶还原糖含量相对空白样品的减少量Tab.2 The decrease percentage of reducing sugar in reconstituted tobacco comparing with blank control under different pH conditions

2.2.4 氨基酸用量的影响

萃取液中还原糖∶氨基酸（摩尔比）=1∶1 时，催化剂FeCl3浓度为0.01 mmol/L，K2CO3调 节pH 至6.2 左 右，70 ℃恒温加热2.5 h，反应液减压浓缩至原体积的1/4至1/5，并于（165±2）℃烘箱中烘烤2 min，制备的再造烟叶经评吸，类似可可的烘烤味增加。这是由于氨基酸加入量过多，美拉德反应程度较高而造成的影响。为能在保证再造烟叶吃味无明显变化的基础上降低其还原糖含量，将氨基酸用量减少至萃取液中还原糖∶氨基酸（摩尔比）=1∶0.5，其他条件不变。分析结果如图4所示。由图4 可知，降低氨基酸用量后，相对于空白样品，再造烟叶还原糖含量不同程度降低，其中，赖氨酸效果最好，其次是甘氨酸和脯氨酸，相对于空白分别降低了10.6%，9.1%和6.0%，降低量约为还原糖和氨基酸的摩尔比为1∶1 时的一半左右。

图4 还原糖和氨基酸的摩尔比为1∶0.5 时不同氨基酸处理的再造烟叶中还原糖的含量Fig.4 The contents of reducing sugar in reconstituted tobacco treated with different amino acids at 1∶0.5 mole ratio of reducing sugar and amino acid

2.3 感官评价结果

不同氨基酸处理制备的再造烟叶与空白对照样品的感官评价结果见表3。由表3 可知，加脯氨酸处理的再造烟叶与空白对照样品相似；加赖氨酸处理的再造烟叶总分略低，灼烧感和青杂气稍突出，这可能与赖氨酸分子中含有两个氨基有关；由加甘氨酸处理制备的再造烟叶总体评价好于空白对照样品。

表3 不同氨基酸处理制备的再造烟叶的感官评价结果Tab.3 Sensory evaluation results of reconstituted tobacco treated with different amino acids

3 结论

①当萃取液中添加氨基酸使还原糖∶氨基酸（摩尔比）=1∶0.5，Fe3+浓度为0.01 mmol/L，调节pH 至6.2 左右，萃取液经70 ℃加热振荡2.5 h，减压浓缩至萃取液密度约为1.22 g/cm3，所得涂布液以涂布率38%涂于基片上，165 ℃下烘烤2 min，可降低再造烟叶中还原糖含量。其中用赖氨酸处理制备的再造烟叶效果最好，相对于空白对照样品还原糖含量降低了10.6%；甘氨酸和脯氨酸分别降低9.1%和6.0%。②感官评价结果表明，与空白对照样品相比，加不同氨基酸处理所制备的再造烟叶的评吸效果为甘氨酸＞脯氨酸≈空白＞赖氨酸。

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