基于代谢组学技术的白金胶囊治疗抑郁症的研究

杨 培 李雪春 林龙飞 田晶辰 倪 健

（北京中医药大学中药学院，北京，100029）

基于代谢组学技术的白金胶囊治疗抑郁症的研究

杨 培 李雪春 林龙飞 田晶辰 倪 健

（北京中医药大学中药学院，北京，100029）

目的：利用代谢组学技术探讨白金胶囊治疗抑郁症的机制。方法：以SD大鼠为研究对象，采用慢性不可预知应激制备抑郁大鼠模型。在进行脑代谢组学研究之前，采用体质量、糖水消耗量、旷场试验测定结果为指标评价建模效果和白金胶囊抗抑郁疗效。脑代谢组学研究采用液质联用技术结合SPSS、SIMACA-P软件分析测定结果，通过数据库（MASSBANK、METLIN、HMDB和KEGG）检索和文献分析，寻找出和抑郁相关的脑组织样本中的生物信息。结果：测得脑组织样本中共1 194种化合物。PCA和OPLS-DA分析结果显示，得分矩阵中的空白组、模型组和药物组分别集中分布在3个不同区域，说明存在组间差异；结合载荷矩阵和VIP值进行搜库查询及文献分析，得到牛磺酸、苏糖酸、N-乙酰天冬氨酸和肌苷4个主要化合物。结论：白金胶囊的抗抑郁药效与其改变脑内氨基酸水平、作用于中枢神经系统神经递质及参与能量代谢有关。

代谢组学；液质联用技术；抑郁

生物标志物包含着可能改善人类生存环境的信息。通过提供更早、更精确的诊断测试基础依据，生物标志物可以帮助临床医生发现和治疗疾病。同时，其作为终端替代物，还可以帮助研发出更好更多的目标药物来治疗疾病。寻找生物标志物遵循一定的联系统一性，从开始发现到巩固结束，经过证实的生物标志物可以广泛地使用在临床应用中。例如，心脏衰竭可以通过测量B-natriuretic peptide水平来进行精确诊断［1-2］，某些类型的癌症筛查和监测可以通过特定的肿瘤标志物实现［3-4］。对于抑郁症这样一种暂无实验室诊断指标的疾病来说，生物标志物的研究不仅有助于抑郁症的诊断和治疗，对于抗抑郁药物的研发具有重要的意义。已有研究表明，重症抑郁患者外周系统中脂类和氨基酸类成分的浓度水平出现了异常的变化［5］。代谢组学的研究能够寻找出于抑郁疾病相关的生物标志物，其可能作为潜在的评价指标被应用于未来抗抑郁药物的研发。本研究采用慢性不可预知应激制备抑郁大鼠模型，以路优泰作为阳性对照药物，以糖水消耗量、行为学指标等评价模型建立成功与否及白金胶囊的抗抑郁药效。在此基础上，采用液质联用技术采集正常大鼠、抑郁大鼠和白金胶囊治疗大鼠脑组织样本中的信息，SPSS和SIMACA-P软件相结合对其进行分析，以期寻找出和抑郁、白金胶囊相关的脑组织样本中生物信息，探讨白金胶囊治疗抑郁症的作用，为白金胶囊的进一步研究提供参考。

1 资料和方法

1.1 一般资料 SD大鼠雄性大鼠40只［清洁级，（250±10）g］，许可证号：SCXK（京）2012-0001，购自维通利华实验动物有限技术公司。实验前动物适应性饲养1周，自由摄食饮水。1周后根据体质量随机分为正常组和抑郁模型组，正常组10只，抑郁模型组30只。路优泰（圣.约翰草提取物，批号：2500711，Dr.Willmar Schwabe GmbH＆Co.KG，Germany），白金胶囊（北京中医药大学倪健教授课题组自制，批号：201303），乙腈和甲酸（色谱级，Fisher Scientific，NJ，USA），超纯水（18.2 mΩ.cm）。Waters ACQUITY UPLC/Xevo G2 Q-TOF（Waters，USA）。

1.2 方法

1.2.1 抑郁大鼠的制备与分组 适应性饲养1周后，采用慢性不可预知应激制备大鼠抑郁模型。除正常组外，应激大鼠每天随机接受不同的刺激并在造模过程中保持孤养状态，共32 d。实验中采取的刺激方法见表1。

表1 慢性不可预知应激制备大鼠抑郁模型工作表

造模结束后，对大鼠进行体质量的测定，糖水消耗量的测定以及旷场试验相关指标的测定。数据结果采用SPSS 17.0软件进行分析。将已经制备好的抑郁大鼠按照体质量随机分为2组，即抑郁模型组、路优泰组、白金胶囊组。给药组采用灌胃给药的方式，分别给予白金胶囊0.389 5 g/d，路优泰0.018 g/d连续28 d。1）糖水消耗实验：禁水12 h后同时放入饮用水和1%蔗糖水，2 h后用量筒读取各只大鼠的饮用水量及蔗糖水消耗量，计算糖水消耗百分比。2）旷场试验：旷场试验在长、宽、高分别为90 cm、90 cm和45 cm的木制敞箱进行。每只动物测试1次，5 min/次。每只大鼠测试完毕以后用75%乙醇擦拭箱内，确保无排泄物和气味残留对试验结果产生影响。测试过程保持环境安静，测试数据使用Ethovision软件进行分析。

1.2.2 样本的处理 给药结束后第2天同样测定体质量、糖水消耗量等指标，测定完毕后次日处死大鼠，迅速分离全脑，称重后按重量体积比1∶1加入冰甲醇溶液匀浆，-25℃冷冻备用。测定前样本常温解冻，加入等体积乙腈-水（3：1）溶液提取，涡旋1 min，离心取上清液，待测。

1.2.3 质谱条件和液相条件 采用负离子检测模式的ESI电离方式，质量扫描范围为50～1 400 M/Z。毛细管电压：2 500 V；干燥气流体积流量：700 L/H；干燥气温度：400℃。

色谱柱：Waters UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流动相：A（水-0.1%甲酸）和B（乙腈-0.1%甲酸）；柱温：50℃；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；洗脱程序见表2。

表2 流动相梯度变化表

2 结果

2.1 CUMS模型筛选结果 造模结束后，进行大鼠体质量、糖水消耗量和旷场实验的测定，其相关测定指标结果见表3。从表的结果可以看到，模型组与正常大鼠比较，体质量、糖水消耗量显著下降。模型组大鼠平均体重为414 g，空白组为520 g；模型组糖水消耗量从空白组的34%下降至16%；旷场试验测得的中央格穿刺次数从空白组的5次下降为1次，平均运动速度和运动总距离降低约50%，说明采用慢性不可预知应激制备抑郁模型成功。路优泰治疗的抑郁大鼠，体质量无明显变化，但糖水消耗量、中央格穿刺次数和平均运动速度、距离均向着空白组的方向有明显恢复。经白金胶囊治疗的抑郁大鼠，平均体质量回复至484 g，平均糖水消耗量增至24%，中央格穿刺次数增至3次，平均运动速度和运动距离回复至空白组的80%左右。体质量和糖水消耗量的增长说明大鼠的食欲有所增加，抑郁带来的兴趣丧失有所好转。综上所述，白金胶囊能在一定程度上治疗慢性不可预知应激造成的抑郁症。在此基础上，进一步对白金胶囊组、抑郁模型组和正常组大鼠大脑组织匀浆进行代谢组学的研究。

2.2 代谢组学图谱及数据解析 采用MZmine软件提取质谱峰并进行反卷积处理去噪音、缝隙填补处理等，最终检测到1 194个离子，其总离子流图见图1。在此基础上对代谢图谱进行数据解析，PCA初步分析各组之间样本的总体分布情况、自然聚集情况和奇异样本的情况。最终得到的2个主要的部分：得分矩阵（白金胶囊组为红色点，抑郁模型组为绿色，正常组为黑色。右边是立体图。该空间中每一个点代表一个样本）和载荷矩阵（该空间中每一点代表一个指标（ID：M/Z.RT）），如图2所示。其中得分矩阵可以看出3组间存在统计学意义，但相对于正常组和抑郁模型组而言，白金胶囊组的样本较分散，个体间差异明显，其中白金胶囊组一只大鼠在样本制备时出现操作失误，将此数据剔除后E组的有效样本量为9。

表3 抑郁指标测定结果（n＝10）

图1 大鼠脑组织典型总离子流

图2 各组大鼠主成分分析得分图（左）和载荷图（右）

OPLS-DA作为有师监督的方法，可以去除与分类无关的变量，使判断集中在与类别相关的变量上，从而提高分类的准确性，消除过拟合。分别对白金胶囊组E、抑郁模型组M和正常组N进行两两比较，E vsM（R2＝0.988；Q2＝0.603），E vs N（R2＝0.994；Q2＝0.756），M vs N（R2＝0.996；Q2＝0.742），寻找差异候选物。结合以下4个数据库以及相关的文献，对化合物的结构确认，推测结构化合物与该疾病的相关性。MASSBANK（http：//www.massbank.jp/index.html）METLIN（http：//metlin.scripps.edu/metabo＿search＿alt2.php）HMDB（http：//www.hmdb.ca/）KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）

牛磺酸（Taurine）、苏糖酸（Threonic acid）、N-乙酰天冬氨酸（N-acetylaspartate）和神经再损伤蛋白（Inosine）4个化合物被确证为潜在的抑郁生物标记物，其质谱相关信息见图3，白金胶囊可以有效地使抑郁大鼠大脑中上述化合物浓度水平变化往正常组的方向回复。已有研究表明，Taurine水平在精神分裂症患者血浆和脑脊液中有所下降，Taurine与神经系统的活动密切相关［6-9］，参与到神经受体或配体的激活通路中，与5-HT、GABA等受体有紧密连接。N-acetylaspartate是天冬氨酸的衍生物，它是大脑除谷氨酸以外大脑中浓度最高的氨基酸，它参与脑液神经元平衡渗透分子，还是脂质和髓鞘合成原料，与神经胶质细胞、磷脂神经细胞轴突相关，是重要神经元合成前体，还参与能量的合成和转化；研究还表明，海绵状脑白质营养不良时脑中N-acetylaspartate的含量会显著降低［10-11］。因此推测白金胶囊的抗抑郁药效与其改变脑内Taurine水平、作用于中枢神经系统神经递质有关。此外，抑郁症一个重要的表现是兴趣丧失，自主活动减少——能量降低。相关文献报道结果显示，Threonic acid参与到能量代谢的全过程，直接影响到酮戊二酸的合成和柠檬酸循环的进行，与氨基酸的代谢密切相关［12-13］。Inosine与ATP的转化密切相关，其研究始于1983年，研究还表明，Inosine水平与睡眠时间长短有关［14］。海绵状脑白质营养不良时脑中Inosine的含量也会显著降低［11］。查询KEGG的代谢通路图，Inosine是以嘌呤代谢物的形式出现在脑部，它同样参与到ADP、ATP的能量转化过程。模型组中Threonic acid和Inosine的含量相对正常组降低，经药物治疗后上升，即能量的变化过程，与二者的代谢过程相呼应，推测白金胶囊治疗抑郁的一个关键步骤为参与能量代谢的过程。

图3 四种化合物相关信息一览表

3 讨论

大鼠和小鼠作为行为神经学研究中最常用的动物模型，它们能够表现出与人类疾病相关的各种行为。在神经行为研究的初期，大鼠是最常用的模式生物［15］。已有研究成功将CUMS用于抑郁大鼠动物模型的制备，并被认为是一种良好的疾病造模方法［16-17］。大鼠在许多标准的神经药理学任务中表现良好，而且它们的身体大小使我们更容易对其进行侵入性操作。无论是代谢组学研究还是抗抑郁药的药效研究中，采用慢性不可预知应激制备抑郁大鼠模型被普遍认可和接受［18-19］。

基于代谢组学的思想，通过分析内源性或外源性（药物产生）代谢物组的变化，我们可以分析生物体的状态，捕捉到和疾病相关的生物信号，推测生物体内代谢通路的变化，为疾病的诊断或治疗药物的研发提供指导。已有科研人员将研究重点放在抑郁动物模型的血浆或尿液样本的整体代谢物研究上，主要的分析测定方法包括气质联用色谱法、液质联用色谱法和磁共振成像［20-21］；还有一部分研究着眼于研究抗抑郁药物在血浆或尿液样本中的代谢情况［22-23］；作为一种重要的神经系统疾病，抑郁与大脑、中枢神经系统密切相关，因此研究选取大鼠的脑组织作为代谢组学的研究对象。本研究希望以白金胶囊作为中药复方抗抑郁药物的代表，从系统生物学的研究角度出发，结合代谢组学的研究技术，为抗抑郁中药的研究提供新的思路。

［1］Harutyunyan，M.The inflammatory biomarker YKL-40 as a new prognostic marker for all-causemortality in patients with heart failure［J］. Immunobiology，2012，217（6）：652-656.

［2］Saenz，A.J.Measurement of a plasma stroke biomarker paneland cardiac troponin T in marathon runners before and after the 2005 Boston marathon［J］.Am JClin Pathol，2006，126（2）：185-189.

［3］Buettner，R.and C.Heydt.Biomarker analysis from a pathologist's view. Founding the rationale for personalised treatment of lung cancer［J］. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz，2013，56（11）：1502-1508.

［4］Kondo，T.Inconvenient truth：Cancer biomarker development by using proteomics［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1844（5）：861-865.

［5］Zheng，P.Peripheral metabolic abnormalities of lipids and amino acids implicated in increased risk of suicidal behavior in major depressive disorder［J］.Metabolomics，2012，9（3）：688-696.

［6］Gonzalez-Quevedo，A.Amino acids as biochemicalmarkers in epidemic and endemic optic neuropathies［J］.Rev Cubana Med Trop，1998，50（s）：241-244.

［7］Sturman，J.A.Tissue taurine content，activity of taurine synthesis enzymes and conjugated bile acid composition of taurine-deprived and taurine-supplemented rhesusmonkey infants at6 and 12 mo of age［J］.J Nutr，1991，121（6）：854-862.

［8］Gonzalez-Quevedo，A.Amino acid levels and ratios in serum and cerebrospinal fluid of patientswith optic neuropathy in Cuba［J］.Nutr Neurosci，2001，4（1）：51-62.

［9］Do，K.Q.Gamma-Glutamylglutamine and taurine concentrations are decreased in the cerebrospinal fluid of drug-naive patients with schizophrenic disorders［J］.JNeurochem，1995，65（6）：2652-2662.

［10］Rothstein，J.D.Abnormal excitatory amino acidmetabolism in amyotrophic lateral sclerosis［J］.Ann Neurol，1990，28（1）：18-25.

［11］Tavazzi，B.Simultaneous high performance liquid chromatographic separation of purines，pyrimidines，N-acetylated amino acids，and dicarboxylic acids for the chemical diagnosisof inborn errors ofmetabolism［J］. Clin Biochem，2005，38（11）：997-1008.

［12］Harding，J.J.Sugars including erythronic and threonic acids in human aqueous humour［J］.Curr Eye Res，1999，19（2）：131-136.

［13］Guneral，F.and C.Bachmann，Age-related reference values forurinary organic acids in a healthy Turkish pediatric population［J］.Clin Chem，1994，40（6）：862-866.

［14］Harkness，R.A.and R.J.Lund，Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine，xanthine，uridine and inosine：high concentrations of the ATPmetabolite，hypoxanthine，afterhypoxia［J］.JClin Pathol，1983，36（1）：1-8.

［15］Crawley，J.N.Behavioral phenotyping of rodents［J］.Comp Med，2003，53（2）：140-146.

［16］Zhang，Y.Chronic antidepressant administration alleviates frontal and hippocampal BDNF deficits in CUMS rat［J］.Brain Res，2010，1366：141-148.

［17］Ossowska，G.Antidepressants in chronic unpredictable mild stress（CUMS）-induced deficit of fighting behavior［J］.Pol JPharmacol，2004，56（3）：305-311.

［18］Liu，X.J.Urinary metabonomic study using a CUMS ratmodel of depression［J］.Magn Reson Chem，2012，50（3）：187-192.

［19］Pan，Y.Impaired hypothalamic insulin signaling in CUMS rats：restored by icariin and fluoxetine through inhibiting CRF system［J］.Psychoneuroendocrinology，2013，38（1）：122-134.

［20］Jia，H.M.Integration of（1）H NMR and UPLC-Q-TOF/MS for a comprehensive urinarymetabonomics study on a ratmodel of depression induced by chronic unpredictable mild stress［J］.PLoS One，2013，8（5）：e63624.

［21］Zhang，F.Metabonomics study of urine and plasma in depression and excess fatigue rats by ultra fast liquid chromatography coupled with ion trap-time of flightmass spectrometry［J］.Mol Biosyst，2010，6（5）：852-861.

［22］Wang，X.Metabonomics approach to assessing themodulatory effects of St John's wort，ginsenosides，and clomipramine in experimental depression［J］.JProteome Res，2012，11（12）：6223-6230.

［23］Su，Z.H.Urinary metabonomics study of anti-depressive effect of Chaihu-Shu-Gan-San on an experimentalmodel of depression induced by chronic variable stress in rats［J］.J Pharm Biomed Anal，2011，55（3）：533-539.

（2014-05-05收稿 责任编辑：王明）

Study on Anti-dep ression of Baijin Capsule based on M etabolom ics

Yang Pei，Li Xuechun，Lin Longfei，Tian Jingchen，Ni Jian
（School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Objective：To explore themechanism of Baijin capsule in the treatment of depression based onmetabolomics.Methods：SD ratsmodeled by Chronic Unpredictable Mild Stressweremade as experimental objects.The effect ofmodeling and antidepressant efficacy of Baijin capsule was appraised before the study of brain metabolomics with the results of determination including the body weight，sucrose consumption and open field trial.Additionally，the study attempted to find out the biological information related to depression in samples of brain tissue based on brainmetabolomics research.Pharmacokinetics research wasobtained by the combined resultof LC-MS/MS and analytical software SPSS/SIMACA-P and retrieval of database（MASSBANK，METLIN，HMDB and KEGG）and literature analysis.Results：One thousand one hundred and ninty four compoundswere determ ined by Metabolom ics.The results of PCA and OPLS-DA indicated that the scorematrix in normal group，CUMSgroup and drug group were distributed in three different areas whichmeant that therewas a difference between groups.Fourmain indicators of compound taurine，threonic acid，N-acetylaspartateand inosinewere identified by integrating load matrix，library search and literature analysis.Conclusion：Baijin capsule is able to regulate the brain as an antidepressant by adjusting the levels of amino acids，effecting on central nervous system of neurotransmitter and energymetabolism.

Metabolomics；LC-MS/MS；Depression

R277.7

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.10.026

科技重大专项课题-白金胶囊治疗精神性疾病—抑郁症的研究与开发（编号：2012ZX09103201-026）

倪健，教授，现任北京中医药大学中药学院副院长，主要研究方向：药物新剂型、新技术及其体内过程，Tel：（010）84738607，E-mail：njtcm＠263.net