BD FACSAriaIII流式细胞仪在血液学中的使用分析研究*

梁昊岳 程雪莲 杨晚竹 王金宏*

BD FACSAriaIII流式细胞仪在血液学中的使用分析研究*

梁昊岳①程雪莲①杨晚竹①王金宏①*

目的：对BD FACSAriaIII流式细胞仪在应用中出现的故障原因进行分析、研究，为在科研工作中正确使用该仪器提供依据。方法：通过对2012-2013年实验血液学国家重点实验室技术平台BD FACSAriaIII流式细胞仪的使用情况进行统计，对使用过程中出现的常见故障和需要由厂商工程师现场解决的故障进行统计，总结出高发故障的原因及解决方法。结果：通过对BD FACSAriaIII流式细胞仪的故障进行分析，为高通量流式细胞分选仪的正确使用提供指导，提高仪器运行的稳定性。结论：正确的使用和良好的维护有助于保证BD FACSAriaIII流式细胞仪的正常运行，从而确保科研工作的顺利进行。

流式细胞仪；工作原理；故障分析

1973年BD公司与斯坦福大学合作研发出全球第一台商业化流式细胞仪以来，流式细胞仪得到更新和发展，被广泛的应用于临床和科研领域。流式细胞仪既可分析细胞的物理性质如细胞大小，又可分析细胞的生物化学性质如细胞周期分布、DNA含量等[1]。近年来，流式细胞仪在免疫学、肿瘤学及血液学等诸多科学领域里发挥着不可替代的重要作用[2-5]。尽管在传统的应用流体力学聚焦原理的流式细胞仪基础上，发展出了应用声波聚焦原理的流式细胞仪、微毛细管技术为核心的流式细胞仪、将流式细胞检测与荧光显微成像相结合的显微成像流式细胞仪和采用金属元素标记物识别细胞信号分子的质谱流式细胞仪等，BD FACSAriaIII始终作为流式细胞分析和分选的主流机型被广泛使用[6-8]。本研究在介绍BD FACSAriaIII分选型流式细胞仪的工作原理的基础上，对近3000 h的使用记录进行统计，列举常见故障、故障原因及处理方法；对需由厂商现场解决的故障进行统计，列出高发故障分类及处理方法。通过分析两者的统计数据，对流式细胞仪的正确使用提供借鉴，保证FACSAriaIII在科研中发挥有效地支撑作用。

1 流式细胞仪的工作原理

1.1 分析型流式细胞仪的工作原理

在分析型流式细胞仪工作前将不同方式制备的单细胞悬液置于流式管内，以外加压力使待测样品压入流动室，不含细胞的鞘液从鞘液管内喷出，单细胞悬液在细胞流动室内高速流动并形成圆形流束，细胞呈单行排列依次通过激光检测区。控制鞘液的装置由压力系统和压力感受器组成，调节好鞘液压力和样本管压力，鞘液流包绕样品并使样品流束保持在液流的轴线方向，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。细胞通过检测区受激光照射而向空间发射散射光或荧光，其信号通过各种光学镜接收，并由以光电倍增管检测器转变为电信号，转换成数字信号后由计算机获取数据贮存、处理和分析，可得到多种信息参数，输出各种图形及统计结果。输出图形分为一维单参数直方图、二维点图、等高图和假三维图等[9]。

1.2 分选型流式细胞仪的工作原理

分选型流式细胞仪在具备分析型流式细胞仪功能的同时还具有细胞分选功能。细胞的分选通过分离含有单细胞的液滴来实现。在流动室的喷口上安装有超高频电晶体，充电后可以振动，将喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞分散于液滴中间。将液滴充入正、负电荷后，当液滴流经偏转板的高压静电场时向左或右偏转，落入各自的收集容器之中，未充电的液滴落入废液容器中，从而完成细胞的分离[10]。

紧急切断阀与普通开关阀的主要功能区别在于紧急切断阀在发生事故时仍能执行动作且响应快速，因此在选型时对于紧急切断阀的配置要求更高。笔者在设计过程中除了依据SH/T 3005—2016《石油化工自动化仪表选型设计规范》[5]，还重点参考了《液化烃球罐紧急切断阀选型设计规定》(中国石化建[2011]518号文)，该规定对于紧急切断阀的技术性能、阀门材质、执行机构选型、检验与测试等都做了比较详细的规定。

2 流式细胞仪在科研使用中的故障分析案例

2.1 样品上机后电脑软件显示细胞信号有误

(1)故障发生的原因：①鞘液不足；②软件中阈值设置过高；③上样针堵塞；④鞘液过滤器堵塞；⑤气泵损坏；⑥laser delay不合适；⑦激光电源未开启；⑧激光shutter未开启。

(2)故障处理方法：①检查鞘液桶内鞘液量，如鞘液量过少则更换为充满溶液的鞘液桶；②查看BD FACS Diva软件中的阈值设置，将其调为5000正常值后重新上样；③单击Cytometer下“Cleaning Modes”中的“Sample Line Backflush”反冲上样针3～5次后重新上样，若上样针轻度堵塞，反冲后应可恢复正常，若反冲无效可取BD Clean溶液于流式管中，冲洗上样针和管路15 min，再无效可考虑更换上样针；④更换上样针之前可考虑鞘液过滤器堵塞，将过滤器取下并短接，重新上样，上样前应保证激光电源和激光shutter开启；⑤检查液流车上的压力显示器，若其显示为零或数值很低则表示气泵可能损坏，应更换气泵；⑥若质量控制显示仅为红色激光和紫外激光通道无信号，可考虑为激光延迟(laser delay)，单击Diva软件窗口中的“Laser”页面，在红色激光或紫外激光中的“Delay”栏中以“0.1”为数值间隔逐渐调节激光延迟时间数值，观察APC-A或Hoechst Blue-A直方图，使其平均荧光强度达到最高值。直方图中峰形状越尖细表明仪器状态越好，合格的质量控制图形如图1所示。

图1 BD FACSAriaIII质量控制流式图

2.2 样品上机后电脑软件显示杂质较多

(1)故障发生的原因：①软件中阈值设置过低；②流动室不洁净；③样本中死细胞或碎片较多；④样本被污染。

(2)故障处理方法：①重新设置阈值，特别是调高FSC阈值，显示的碎片会减少；②执行“Cleaning the flow cell”程序，清洗流动室[11]；③在显微镜下观察确定样本中是否含有较多的死细胞或碎片，并确保样本无污染。每日分选结束后应执行“关闭”(Shutdown)程序，使用75%酒精充分清洗仪器管路，保持管路无污染。分选样本前可采用加入抗生素的PBS或培养基冲洗管路15 min，以确保管路无菌。

2.3 液流显示异常

(1)故障发生的原因：①喷嘴放置不正确；②鞘液不足；③液路内有气泡；④鞘液过滤器内有气泡；⑤喷嘴堵塞。

(2)故障处理方法：①单击“Stream”键关闭液流，将喷嘴取下后重新安装，注意保证O圈向上插入喷嘴，再重新开启液流；②检查鞘液桶内鞘液量是否过少；③如加入鞘液后仍显示液流异常，执行“Cytometery”下“Prime After Tank Refill”程序3～5次，排净管路内的气泡；④执行“Purging the Sheath Filter”程序3～5次，排净鞘液过滤器内的气泡，如无效则说明喷嘴可能堵塞；⑤样本预处理质量差、鞘液盐结晶或管路细菌污染均会造成喷嘴小孔堵塞[12]。关闭液流取下喷嘴后将置于流式管中，向管内加入无菌纯水(没过喷嘴)盖上流式管帽，放入盛有水的小功率超声仪中2～3 min后取出，用75%酒精喷洒灭菌后重新将喷嘴装上，重新开启液流检查其是否恢复正常。如液流仍异常可尝试使用无菌棉签擦拭分选仓中喷嘴下方区域可使液流显示正常。

为保证喷嘴不堵塞，分选的样本应在上样前使用300目滤网过滤再行分选。分选大细胞时应使用较大孔径的喷嘴，以避免堵塞。使用AriaIII进行分选时样本浓度应≤107/ml，上样速率≤15000 events/s。

2.4 分选细胞后未得到目的细胞

(1)故障发生的原因：①偏转电压设置不当；②“Drop delay”设置不当；③分选仓或偏转板不洁净；④分选逻辑混乱。偏转电压设置不当会导致偏转液流未进入收集管中，造成目的细胞损失。“Drop delay”设置不当会造成目的细胞进入废液收集管而造成损失。鞘液中的无机盐成分会在分选过程中飞溅至分选仓和偏转板上，结晶后造成偏转异常。分选中“parent”和“child”门内的细胞同时被选中并进行分选，造成分选逻辑混乱，不能得到正常数量的目的细胞。

(2)故障处理方法：①调整偏转电压，在分选前应打开分选仓门→单击Diva软件分选界面的“Voltage”和“Test Sort”→观察偏转液流→调节偏转电压，使偏转液流进入流式收集管中→使用微孔板进行分选时需调节“Far Left”→单击“Test Sort”使偏转液流进入微孔板孔中[13]；②重调Drop delay→在FACS Diva软件界面中建立流式散点图，横、纵坐标分别为FSC-A、SSC-A→设置一个尽量小的矩形门P1于流式图的右上方→在等级图中右键单击P1后选中“Invert Gate”→生成NOT P1门→单击“Load”将已稀释的Accudrop Beads上样→打开分选窗口，将Device设为“2Tube”→Precision设为“Purity”→Target Events设为“Continuous”→Left设为“NOT P1”→调整细胞流速为1500～2000 events/s→调节电压使P1门内细胞比例为100%→打开“Voltage”和“Optical Filter”，此时侧液流窗口出现两个框→调整Drop delay值，使左框中的光斑值≥95%→将Precision分别改为“Initial”和“Fine Tune”→调整Drop delay值，使左框中的光斑值≥95%，Drop delay调节完成后不能更改Drop 1值，分选时需使Sweet Spot保持开启[14]；③清洁偏转板和分选仓可用无菌棉签蘸75%酒精仔细擦拭，最后用干燥无菌棉签擦干，调整偏转电压时偏转电压不宜过大，以免分选过程中过多液滴飞溅到分选仓和偏转板上，分选过程中如发现偏转液流异常应及时结束分选，避免液滴飞溅；④分选中“parent”和“child”门内的细胞不能被同时分选。

2.5 电脑软件不能控制机器

(1)故障发生的原因：电脑软件与机器连接失败。

(2)故障处理方法：可单击“Cytometer”下的“Connect”键尝试再次连接，如软件显示“Disconnected”可再尝试3～5次，若始终不能连接，可依次关闭软件、电脑、机器和稳压电源15 min后再依次打开稳压电源、机器、电脑和软件，即可顺利连接。

2.6 鞘液桶接口处渗水

(1)故障发生的原因：O圈磨损。

(2)故障处理方法：关闭液流，将鞘液连接管取下后将接口处元件取下，更换新O圈，重新安装接口处元件并用生胶带缠裹。安上鞘液连接管开启液流，检查接口处是否渗水，如未渗水则检修完成。

3 需要厂商工程师现场处理的故障

数据统计结果显示，2012-2013年技术平台FACSAriaIII流式细胞仪在正常使用中共计维修24次。常见故障包括光路偏离、硬件损坏、软件损坏和其他故障等，其故障发生频率和分类排序如图2所示。

图2 BD FACSAriaIII仪器故障分类图

3.1 光路偏离

(1)光路偏离是在科研使用中出现最多的故障。488 nm、561 nm、633 nm和375 nm激光光路均可能发生不同程度的偏离，其中375 nm激光光路偏离频率最高。上样后无细胞显示或显示异常，经处理无效则可能发生光路偏离。室温过高是发生光路偏离的主要原因。因此，在日常使用中安放仪器的房间室温应＜20 ℃，使发生光路偏离的可能降到最低。

(2)光路偏离的解决方法是校正光路，使激光经光纤传到至棱镜，再传送至聚焦透镜，最终聚焦于光胶耦合的石英杯流动室内。

3.2 硬件损坏

(1)硬件损坏包括激光损坏、激光光纤损坏、激光电源损坏、制冷装置损坏、排风扇不运转、高压板损坏、石英杯损坏、气泵损坏及喷嘴损坏等。硬件损坏的原因包括高负荷使用、自然老化、使用不当和日常维护不到位等[15-17]。

(2)硬件损坏的解决方法是由厂商工程师在定期保养维护中检查仪器硬件的工作状态，及时检修有故障的硬件，提高其使用寿命。硬件不能使用时应及时更换。激光器衰减会导致荧光通道信号减弱，及时发现后可提示使用者适当降低流式细胞仪工作负荷，延缓激光器衰减速度。气泵上起单向阀作用、防止气体倒流的弹簧片在仪器高负荷运转时易被震碎，及时发现后可更换弹簧片，延长气泵的使用寿命。操作者在日常使用中应注意硬件的保护，在未打开液流的情况下不应开启激光器，以免激光直接照射在石英杯流动室上，造成流动室损坏[18-19]。

3.3 软件损坏

(1)FACSDiva软件损坏会导致流式细胞仪不能正常使用。软件损坏的主要原因是计算机病毒。

(2)软件损坏的解决方法是重装软件或在重装电脑系统后再安装软件。在使用AriaIII流式细胞仪后不能够使用未格式化的U盘拷贝数据，安装FACSDiva软件的电脑不宜连接互联网，也不宜安装其他操作软件，避免其与FACSDiva产生冲突。安装Diva汉化版软件会造成Diva不能使用。同时，使用ghost软件对系统进行备份有助于在出现故障时简便及时地恢复系统设置，保证AriaIII的正常使用[20]。

4 结论

流式细胞仪因具有准确、快速、灵敏及高通量等优点，并与其他生物学技术有机结合成为细胞生物学研究的重要手段[21]。科研人员操作使用BD FACSAriaIII的科学方法有助于提升仪器运行的稳定性。只有正确使用流式细胞仪并对其进行定期维护，才能保证临床和科研工作的顺利进行，延长流式细胞仪的使用寿命。

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Application of BD FACSAriaIII flow cytometer in the research

LIANG Hao-yue, CHENG Xue-lian, YANG Wan-zhu, et al

China Medical Equipment,2014,11(4):4-7.

Objective: To provide a basis for proper use of BD FACSAriaIII flow cytometer by analyzing the related causes of its malfunction. Methods: Through study of using BD FACSAriaIII flow cytometer in core facilities of State Key Laboratory of Experimental Hematology in 2012-2013, frequently occurred malfunction, solved malfunction by manufacturer’s engineers and their causes and solutions are summarized. Results: To provide guidance of using high throughput cell sorters and improve the stability of running the instrument. Conclusion: Proper use and good repair helps to guarantee the normal operation of BD FACSAriaIII flow cytometer.

Flow cytometer; Operating principle; Malfunction analysis

1672-8270(2014)04-0004-04

R197.39

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2014.04.002

梁昊岳,男,(1987- ),本科学历，技师。中国医学科学院北京协和医学院 血液病医院血液学研究所实验血液学国家重点实验室，从事流式细胞测试工作。

2013-12-27

国家自然科学基金(81001377)“倍半萜内酯类活性成分的分离、衍生化及抗白血病干细胞的活性研究”

①中国医学科学院北京协和医学院血液病医院 血液学研究所实验血液学国家重点实验室 天津 300020

*通讯作者：jyuwang@sina.com