双缩脲试剂在检测蛋白质上的应用研究

陈宁清，郑司雨

1 浙江省医疗器械研究所，杭州市，310009

2 华东理工大学材料科学与工程学院，上海市，200237

双缩脲试剂在检测蛋白质上的应用研究

【作者】陈宁清1，郑司雨2

1 浙江省医疗器械研究所，杭州市，310009

2 华东理工大学材料科学与工程学院，上海市，200237

目的 探讨双缩脲试剂在检测蛋白质应用中，不同检测条件对测试结果的影响。方法 采用双缩脲法，选取三种不同仪器、试剂、校准物进行排列组合，组成27套检测系统，每个检测组合系统对5分样本血清进行检测，得到5个测定值，以全部血清总蛋白的测定值剔除离群值后得出的均值，以此计算出各个检测组合系统运用双缩脲试剂检测蛋白质的偏倚。结果不同检测仪器运用双缩脲试剂检测蛋白质的偏倚，方差齐性(P=0.467)，差异不具有统计学意义(F=1.688，P=0.421)；不同检测试剂运用双缩脲试剂检测蛋白质的偏倚，方差齐性(P=0.574)，比较差异具有统计学意义(F=5.784，P=0.011)；不同校准物运用双缩脲试剂检测蛋白质的偏倚，方差齐性(P=0.467)，比较差异具有统计学意义(F=5.289，P=0.000)。结论双缩脲试剂在检测蛋白质应用中，检测试剂和校准物会对测试结果产生影响，在进行试验比对的时候，有必要对检测试剂和校准物造成的检测偏差进行考虑。

双缩脲；总蛋白；影响因素

0 引言

血清中含量最多的就是血清总蛋白(TP)，血清总蛋白包括白蛋白以及球蛋白两大类。它具有维持血管内正常胶体渗透压和酸碱度、运输多种代谢物、调节被运输物质的生理作用等多种功能，同时它还可以反映我们机体的免疫状况。在临床中对于血清总蛋白检测可以了解我们身体的营养状况、肝脏合成功能、肠道情况、肾脏病变等等，根据血清总蛋白检测结果医生结合其他临床资料就可以对某些疾病做出诊断。

血清总蛋白测定目前常抽取静脉血采用双缩脲比色法测定，它是目前首先推荐的蛋白质定量方法。此法的原理是蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与二价铜离子(Cu2+)作用生成蓝紫色的化合物，这种颜色反应强度在一定浓度范围内与蛋白质含量成正比，经与同样处理的蛋白标准液比较，即可求得蛋白质含量。此反应的优点是清、球蛋的反应性相近，操作简单，重复性好，干扰物质少，为首选的常规方法。但是其也存在灵敏度较差，精度不高的问题。由于目前各医院采用的检测设备、试剂以及校准物是不一样的。特别是不同生产厂家出品的双缩脲试剂盒其组分不同，因此其吸光度也不一样[1]。浙江省体外诊断试剂公共服务平台在产品检测过程中，有必要对这些因素对检测结果的影响做出评价，从而就我们的检测条件进行改进，制定出统一的指导标准，这有利于我们对双缩脲试剂在检测蛋白质的检测结果进行对比分析，便于医生对疾病作出正确的诊断。

1 资料与方法

1.1 材料

(1) 样本血清的来源 每日常规工作后收集新鲜血清27份，制备成5份不同浓度的混合血清，分装于带盖的清洁试管内，共135份。

(2) 检测仪器 本次实验采用三种检测仪器，参考目前临床应用情况，选取应用较为广泛的三种检测仪器，本次检测仪器选取HI-TACHI-7060全自动生化分析仪、OLYMPUS AU400全自动生化分析仪、ADVIA1800全自动生化分析。

(3) 检测试剂 本次实验选取三种检测试剂，参考目前临床应用情况，选取应用较为广泛的三种检测试剂，本次检测试剂选取中生北控、四川迈克、罗氏三个品牌。

(4) 校准物 本次实验选取三种校准物，参考目前临床应用情况，选取应用较为广泛的三种校准物，本次检测校准物选取迈瑞、重庆百克、科华生物三个品牌。

1.2 方法

检测方法采用双缩脲法，三种不同仪器、试剂、校准物进行排列组合，组成27套检测系统，每个检测组合系统对5分样本血清进行检测，得到5个测定值，一共135份检测结果。选择处理后正态性较好的一份血清作为研究对象，测定值与靶值(全部AST的测定值剔除离群值后得出的均值)之差除以靶值，即为偏倚，分别计算出各个检测组合系统运用双缩脲试剂检测蛋白质的偏倚，先用SPSS18.0软件按检测仪器、检测试剂和检测校准物所得到的偏倚进行方差分析，检验差异是否具有统计学意义（P＜0.05表示具有统计学意义），从而确定影响双缩脲试剂检测蛋白质结果的因素。

2 结果

2.1 检测仪器对检测结果的影响

对HI-TACHI-7060全自动生化分析仪、OLYMPUS AU400全自动生化分析仪、ADVIA1800全自动生化分析三组不同检测仪器的135份检测结果进行分析：不同检测仪器运用双缩脲试剂检测蛋白质的偏倚，方差齐性(P=0.467)，差异不具有统计学意义(F=1.688，P=0.421)，详见表1。

表1 不同检测仪器对检测结果的影响Tab.1 Effects of different detection instruments on testing results

2.2 检测试剂对检测结果的影响

对中生北控、四川迈克、罗氏三个品牌三种不同品牌的135份检测结果进行分析：不同检测试剂运用双缩脲试剂检测蛋白质的偏倚，方差齐性(P=0.574)，比较差异具有统计学意义(F=5.784，P=0.011)，详见表2。

表2 不同检测试剂对检测结果的影响Tab.2 Effects of different detection reagents on testing results

2.3 校准物对检测结果的影响

对迈瑞、重庆百克、科华生物三种不同校准物品牌的135份检测结果进行分析：不同校准物运用双缩脲试剂检测蛋白质的偏倚，方差齐性(P=0.467)，比较差异具有统计学意义(F=5.289，P=0.000)，详见表3。

表3 不同校准物对检测结果的影响Tab.3 Effects of different methods of calibration on testing results

3 讨论和结论

目前，血清中蛋白质的检测在临床中已得到广泛运用，血清中蛋白质增高常见于脱水、血液浓缩和多发性骨髓瘤。血清中蛋白质减低常见于血浆水分增加、肝功能障碍、消耗性疾病、营养不良、广泛烧伤、肾病综合征、溃疡性结肠炎、大量反复放胸腔积液和腹水等。因此，血清中蛋白质的检测是医生对疾病诊断、治疗观察、判断预后的重要手段，血清总蛋白测定结果对疾病的诊断虽然不具有一定的特异性，但在临床中可以结合其他资料来对疾病情况进行诊断，因此血清中蛋白质的检测值的准确性和一致性十分重要[2]。目前，双缩脲法是全国临床检验血清总蛋白的常规方法，因此，抛开检测方法影响血清总蛋白检测结果的实验环境就包括检测仪器、试剂以及校准物等[3-4]。从实际情况也可以看出，双缩脲法在各家医院应用的统一性比较强，因此本研究重点分析双缩脲法在检测蛋白质应用中影响其检测结果的检测器材、试剂以及校准物。目前，全国各地经济发展水平不一样，存在城乡差距，各医院的条件存在差距，因此使用的仪器、试剂、校准物也一样。从使用的仪器来看，大多数医院采用的分析仪都是奥林巴斯AU系列、日立HI-TACHI系列，这些分析仪等都经过一定的性能评定，有的经ISO/15189认定，系统误差会很小，偏倚值也不大，而本次研究也证明了这一点[5]。目前检测系统中试剂及试剂盒占有比较重要的地位，对结果影响较大，如比较好的试剂罗氏原装试剂，在实验室分析统计中常作为参照标准以评价其它试剂的质量，但受当前医疗水平的限制，大小医院使用的试剂参差不齐，没有统一的标准。目前，各实验室不断引进新的仪器和检验方法，拥有多台生化仪器，不同的试剂、校准物及试剂盒，为了有效监测重大传染病的发生，保证不同实验室、不同检测系统结果的一致性和可比性，是各中、大型医院检验科追求的目标[6]。

本研究从另一角度通过探讨影响检测结果的主要因素，为临床统一检测条件及准确检测血清总蛋白提供实验依据。本次研究结果表明：不同检测仪器运用双缩脲试剂检测蛋白质的偏倚，方差齐性(P=0.467)，差异不具有统计学意义(F=1.688，P=0.421)；不同检测试剂运用双缩脲试剂检测蛋白质的偏倚，方差齐性(P=0.574)，比较差异具有统计学意义(F=5.784，P=0.011)；不同校准物运用双缩脲试剂检测蛋白质的偏倚，方差齐性(P=0.467)，比较差异具有统计学意义(F=5.289，P=0.000)。不同试剂、仪器和校准物运用双缩脲试剂检测蛋白质的偏倚倚分析表明：(1)蛋白质检测已广泛应用于肝疾病及流行病学的研究，目前实验室的检测方法还是比较统一一直的，均采用双缩脲法。(2)仪器方面，绝大多数医院采用的分析仪如奥林巴斯AU系列、日立HITACHI系列等都经过一定的性能评定，偏倚也应当不大[7]。本次研究结果也表明：不同检测仪器运用双缩脲试剂检测蛋白质的偏倚其差异无统计学意义。(3)双缩脲试剂在检测蛋白质应用中，试剂以及校准物对测试结果的影响较大，在检测中具有重要的地位，由于各地医院发展情况不一，实验环境不同，在临床中还没有形成统一标准，双缩脲试剂在检测蛋白质应用中，不同试剂检测、不同校准物对同一样本的检测结果差异有统计学意义，因此，可以判断影响双缩脲法检测蛋白质检测结果的主要因素为试剂以及校准物。

我国临床实验室对于检测结果的准确性都是非常的重视的，一般实验室还要参加全国或全省的室间质评活动，同时还每天对室内质量会进行控制，但由于检测条件的不同，运用双缩脲法检测蛋白质还是会存在一定的偏差，因此，有必要进行对比试验，才能从根本上解决检测结果准确性和一致性的问题，而对于那些正准备参加实验室认可的医学实验室来说，这项工作就尤为重要了。完整的比对实验它包含比对以及修正，通过对比试验可以采取多种方法对检测流程或结果进行校正：比如可以通过不同仪器测定同一份新鲜血清，对比检测结果来对检测仪器进行校正；也可以通过回归分析的方式，选取影响因子，利用回归方程求解找出影响因子来对其他检测条件进行校正[8]。还可以用混合血清作为共同校准品校准各系统。不同实验室应根据自身情况，反复验证来决定使用何种方法来校正。目前国内相关研究多参考美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)的EP9-A[9]文件，对不同检测系统的测定结果进行方法比和偏倚评估，为实现测定结果的溯源性和可比性提供实验依据。因此，双缩脲试剂在检测蛋白质应用中，检测试剂和校准物会对测试结果产生影响，在进行试验比对的时候，有必要对检测试剂和校准物造成的检测偏差进行考虑。

[1] 王时南, 杨欢. 两种校准品和3种双缩脲试剂测定血清总蛋白结果偏倚评估及方法学评价[J]. 医学研究杂志, 2011(10): 125-128.

[2] 李晶. 血清总蛋白测定方法及临床意义[J]. 中国现代医药应用, 2012(9): 28-29.

[3] 张玲, 张玉春. 双缩脲法测定血浆总蛋白含量的不确定度评定[J]. 甘肃医药, 2013(2): 126-128.

[4] National Committee for Clinical Laboratory Standards. Method comparison and bias estimation using patient samples; approved guideline,EP9-A[S]. NCCLS, Pennsylvania, 1995.

[5] Doumas BT. Standards for total serum protein assays a collaborative study[J]. Clin Chem, 1975, 21: 1159-1166.

[6] 阎政礼, 姜晓东, 童金英, 等. 不同检测条件下血清总蛋白测定结果的偏倚分析[J]. 实用预防医学, 2010(1): 27-29.

[7] 卢海景, 张红凤, 饶华春. 右旋糖酐对双缩脲法测定血清总蛋白的干扰[J]. 国际检验医学杂志, 2013(20): 2729-2730.

[8] 陈惠. 1163 名健康人血液总蛋白水平的临床分析[J]. 求医问药, 2012(4): 51-52.

[9] The National Committee for Clinic. Laboratory Standards. Method comparison and bias estimation using patient samples: approved guideline[M].Second Edition, EP9-A, 2002.

Application Research of Protein Test by Using Biuret Reagent

【Writers】Chen Ningqing1, Zheng Siyu2

1 Zhejiang Medical Device Institute, Hangzhou, 310009

2 School of Materials Science and Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai, 200237

Objective To investigate the biuret reagent to detect proteins in the application, the impact of different test conditions for test results. Methods The biuret method to select three different instruments, reagents, calibrators are arranged in combination to form 27 sets of detection systems, each detection system is a combination of 5 serum samples for testing, 5 measured values obtained, the selection process normality good a serum for the study to determine the mean value of all AST after culling outliers obtained in order to calculate the various detection systems use a combination of biuret reagent to detect proteins bias. Results The use of different detection equipment to detect proteins biuret reagent bias, homogeneity of variance (P=0.467), the difference was not statistically signifcant (F=1.688, P=0.421). different detection reagents using biuret reagent to detect proteins bias, homogeneity of variance (P=0.574), a statistically signifcant difference (F=5.784, P=0.011). different calibrators use biuret reagent to detect proteins bias, homogeneity of variance (P=0.467), the difference was statistically signifcant (F=5.289, P=0.000). Conclusion Biuret reagent in the detection of protein applications, impact detection reagents and calibrators will test result, during the test than when it is necessary to detect deviation detection reagents and calibrators due to be considered.

biuret, total protein, infuential factors

R446.1

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2014.06.020

1671-7104(2014)06-0458-03

2014-09-28

浙江省体外诊断试剂公共服务平台（2011F30008）

陈宁清，E-mail: cnqcool@126.com