献血者血液单人份核酸检测及血清学检测结果的分析

刘峭梅覃柳燕（广西壮族自治区血液中心，广西柳州 545005）

随着血液检测技术的不断更新，核酸检测（NAT）技术作为一种新的血液病毒筛查检测技术，由于可以直接检测到病原体的核酸，检测灵敏度高、特异好，可大大缩短检测“窗口期”，能够有效地降低经输血途径传播病毒的风险。在我国，已有一些血液中心和中心血站近几年在血液筛查中引入NAT技术，该技术的引入对保证血液的安全性起到了很大的作用。本中心从2012年9月引进了诺华诊断的Procleix TIGRIS System血液筛查系统，通过3个月的调试安装和培训后于2012年12月起对柳州地区无偿献血者的血液标本进行NAT，现在的检测模式为2个不同生产厂家的酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂和1种核酸试剂同时并行检测，对检测为NAT（＋）ELISA（－）的标本进行鉴别试验。我国2012版《血站技术操作规程》中对HBV、HCV、HIV标志物及其检测方法可有两种选择，一种是继续采用2个不同生产厂家的ELISA试剂检测，另一种选择是1种ELISA试剂和1种核酸试剂检测。作者对本单位2012年12月1日至2013年4月30日采集的18 236份无偿献血者血液标本NAT和ELISA的检测结果以及核酸鉴别试验结果进行比较分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本采集 2012年12月1日至2013年4月30日本中心采集的柳州地区无偿献血者的血液标本18 236份，献血者均符合献血者健康检查要求。每位献血者留取2管标本，分别为5mL的二乙胺四乙酸四钾（EDTA－K2）真空采血管（浙江拱东）和5mL的EDTA－K2分离胶真空采血管（上海科华），其中不含分离胶的采血管用于ELISA检测，而含有分离胶的用于NAT检测。NAT管采集后在4h内离心，各检测在标本采集后48h内完成，不能完成的－20℃密闭保存，7d内检测。

1.2 仪器与试剂 EVO全自动标本处理系统；FAME24／30全自动酶免分析系统；诺华Procleix TIGRIS NAT系统（美国Novartis）；乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）（1家国产试剂和1家进口试剂）；抗－HCV（2家国产试剂）；抗－HIV（1家国产试剂）；HIV Ag／Ab（1家进口试剂）；HIV－1RNA、HCV RNA、HBV DNA三联检核酸试剂（Procleix UltrioAssay）；HIV－1 RNA鉴 别 试 剂（Procleix HIV－1DiscriminatoryProbe Reagents）；HCV RNA鉴别试剂（Procleix HCV Discriminatory Probe Reagents）；HBV DNA鉴别试剂（Procleix HBV Discriminatory Probe Reagents）。所有使用的试剂均为合格试剂且在试剂有效期内使用；所有的仪器均按仪器的要求进行保养和维护，并确保仪器在正常工作状态下运转。

1.3 方法 （1）ELISA检测：将采血管按要求进行离心，ELISA试剂室温平衡后使用EVO一次性加样针进行全自动加样，采用FAME 24／30全自动酶免分析系统进行全自动处理。ELISA两种试剂使用不同的加样系统、不同的分析系统同时检测，按各试剂的检测标准、操作规程进行操作。ELISA两种试剂均无反应性的标本判定ELISA阴性，两种试剂均有反应性的标本判定ELISA阳性；只有单一种ELISA试剂有反应性的标本需进行原试剂双孔复试，复试双孔中有一孔或双孔有反应性的标本判定ELISA阳性，否则判定ELISA阴性。（2）单人份NAT：与ELISA检测平行进行。将含有EDTA－K2分离胶真空采血管按要求进行离心，应用Procleix TIGRIS System血液筛查系统ID－NAT检测模式，采用ULTRIO筛查试剂进行HIV－1RNA、HCV RNA、HBV DNA三联检NAT，筛查无反应性的标本为NAT阴性，筛查有反应性的标本为NAT阳性；筛查有反应性但ELISA检测为阴性的标本，用鉴别试剂进行鉴别确定反应性的项目。

2 结 果

2.1 共18 236份标本，对HBV／HCV／HIV标志物使用NAT与ELISA平行检测，结果NAT阳性标本181份，ELISA阳性246份，其中NAT阳性且ELISA阳性标本117份，NAT阳性且ELISA阴性的标本64份，ELISA阳性且NAT阴性标本129份。结果见表1。

表1 18 236份标本NAT、ELISA并行检测结果[n（%）]

2.2 117份NAT阳性且ELISA阳性标本中，HBsAg阳性100份，占85.47%，其中国产试剂90份，进口试剂100份；抗－HCV阳性12份，占10.25%，国产试剂1为12份，国产试剂2为11份；抗－HIV阳性7份，占5.98%，国产试剂，进口试剂均能检出。7份NAT阳性且抗－HIV阳性标本经疾病预防控制中心（CDC）确证为HIV阳性。

2.3 64份NAT阳性ELISA为阴性标本经鉴别试剂鉴别后，HBV DNA（＋）为18份，HCV RNA（＋）0份，HIV RNA（＋）0份，鉴别阳性率为28.13%。

2.4 129份NAT阴性ELISA阳性标本中，HBsAg阳性53份，其中国产试剂37份，进口试剂39份，23份为两种试剂均为阳性；抗－HCV阳性40份，国产试剂1为32份，国产试剂2为11份，有3份为两种试剂均为阳性；抗－HIV阳性31份，其中，国产试剂5份，进口试剂26份。

3 讨 论

3.1 从表1中看到18 236份标本的检测结果中发现NAT阳性标本181份，ELISA阳性246份，NAT和ELISA都能够有效地检测出不合格标本，但两个检测系统检出的阳性标本并不完全相同，只选择其中一个都存在着漏检的可能。从文中看到117份NAT（＋）、ELISA（＋）的标本中100份为HBsAg（＋）占85.47%，12份抗－HCV（＋），7份抗－HIV（＋）。表明在献血者血液中不合格的项目仍然是HBV。

3.2 从文中看到18 236份标本中检出64份NAT（＋）ELISA（－）的标本，鉴别出18份HBV DNA（＋），HBV漏检率0.99‰。HIV RNA和HCV RNA检出为0，与国内许多血站报道相一致。HBV 0.99‰的漏检率与周边几个城市例如东莞0.9‰[1]，常州1.0‰[2]，南京0.99‰[3]，宝鸡1.14‰[4]相近。值得注意的是在鉴别64份标本中，有46份HBV／HCV／HIV鉴别试验为阴性，比例高达71.87%。这些标本有可能为NAT假阳性也有可能是病毒水平太低造成鉴别试验为阴性。姚凤兰等[5]报道认为单人份NAT检测时常规筛查检测出的阳性标本不能被鉴别是哪种病毒阳性，大多数并非NAT假阳性而是真阳性，之所以无法鉴别的原因是因为病毒水平太低。利用超速离心技术对NAT筛查阳性鉴别试验为阴性的标本进行鉴别，使76.6%（23／30）的常规不能鉴别的标本得到鉴别，确定为HBV[6]。由此可见现所采用的两种试剂检测HB－sAg均存着HBV漏检的现象，NAT有利于提高乙型肝炎病毒的检测能力。

3.3 对于129份NAT（－）ELISA（＋）的标本，从文中看到HBsAg双试剂阳性23份，抗－HCV双试剂阳性3份，103份为ELISA单试剂阳性。对这些标本由于没有进行中和试验或其他的确证试验，也没有进行乙型肝炎病毒标志物的相关检测，因此无法鉴别所有的标本是不是真正的阳性标本，存在着ELISA假阳性的可能，但也存在着由于献血者血液中病毒载量很低，低于NAT的检出水平或病毒处在静默期，导致NAT假阴性的可能。有报道，机体的长期病毒感染导致血液中抗体或抗原滴度很高，不影响ELISA的检出，但血液中存在的HB－sAg是由病毒DNA整合到人染色体与宿主基因共同表达所致，所以检测不到血清中病毒HBV DNA[6]，造成NAT漏检。

3.4 从文中看到现有的两种ELISA试剂检出的阳性数是各不相同的。由于不同的ELISA试剂生产厂家包被的抗原、抗体片段不同或酶标抗体的浓度以及对酶标活性的保护方面采取的方法不同，造成各检测试剂的特异性、灵敏度有所不同。从表中看到进口试剂的灵敏度比国产试剂的灵敏度要高，检出的标本阳性率比国产试剂要高，但两种ELISA试剂中去掉任何一种都有漏检测的可能。

综上所述，NAT检测方法能够检测出因“窗口期”感染、免疫静默期感染、病毒变异等原因而漏检的污染血液[7]，特别对乙型肝炎病毒的检测能力有很大的提高，有条件的采供血单位应开展NAT血液筛查，降低经输血途径传播病毒的风险。但也注意到ELISA可以检测出那些病毒载量低的慢性或持续性感染以及处在病毒静默期感染的标本。WHO《血液筛查建议书》（2009）中建议在考虑将NAT列入筛查策略之前，应首先保证已经有效建立具有质量保证的血清学筛查技术，并对所有的血液实施筛查[8]。从理论上，NAT检测的是病毒核酸，ELISA检测的是病毒抗原或抗体，两者在检测原理及方法上存在差异，因此这两个方法对血液标本的检测都很重要但不是重复而是互相补充，不存在谁替代谁，这两者都应作为血液筛查检测中的重要环节。在选择两种ELISA检测策略中应对ELISA试剂进行考评，尽量选择两种互补性强的试剂，并建议在选择HBsAg试剂时选择高灵敏度、特异性强的进口试剂；在实施NAT后去掉2种ELISA试剂中的任何一种均存在一定的漏检可能，去掉哪种ELISA试剂，需要进行风险效益评估。

[1]师玲玲，刘赴平，王德文，等.核酸检测技术在献血者血液筛查中的初步应用[J].中国输血杂志，2010，23（1）：11－13.

[2]何亚琴，张建伟，杨爱龙，等.核酸检测技术在常州地区献血筛查中的应用[J].中国输血杂志，2011，24（7）：560－562.

[3]蒋呢真，黄成垠，肖那平，等.献血者HBV HCV HIV的单人份核酸检测[J].临床输血与检验，2010，12（3）：208－210.

[4]李晶，周艳，丁卫平，等.核酸检测技术在宝鸡地区血液筛查中的应用[J].中国输血杂志，2012，25（8）：784－786

[5]姚凤兰，任芙蓉，王卓妍，等.超离心浓缩对提高血液NAT筛查不确定标本鉴别率的临床研究[J].北京医学，2009，31（11）：687－690

[6]李金明.临床酶免疫测定技术[M].北京：人民军医出版社，2006：187－196.

[7]颜秀娟，陆祝选，邱昌文，等.核酸检测技术应用于血清学筛查合格的献血者标本检测[J].中国输血杂志，2012，25（12）：1322－1324.

[8]郭永建，池泉，涂东晋，等.WHO血液筛查建议书主要内容介绍[J].中国输血杂志，2010，23（1）：66－72.