UPLC法同时测定盐酸阿糖胞苷原料药的含量和有关物质

海丽萍，杨东菁，王志远，王雪芹（1.河南省直属机关第一门诊部，郑州 45000；.河南大学医学院，河南开封 475001；.河南大学药学院，河南开封 475001；4.河南省食品药品检验所，郑州 45000）

UPLC法同时测定盐酸阿糖胞苷原料药的含量和有关物质

海丽萍1＊，杨东菁2，王志远3，王雪芹4#（1.河南省直属机关第一门诊部，郑州 450003；2.河南大学医学院，河南开封 475001；3.河南大学药学院，河南开封 475001；4.河南省食品药品检验所，郑州 450003）

目的：建立同时测定盐酸阿糖胞苷原料药的含量和有关物质的方法。方法：采用超高效液相色谱法。色谱柱为Inertsil ODS-3C18，流动相为磷酸盐缓冲液-甲醇（梯度洗脱），流速为0.8m l/min，检测波长为254 nm，柱温为40℃，进样量为10μl。结果：尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷、盐酸阿糖胞苷检测质量浓度分别在0.100 8～20.16、0.1～20.12、0.095 6～19.12、0.1～20.004μg/m l范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系（r＝0.999 9、0.999 8、0.999 9、0.999 9）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD≤0.79%；尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷平均加样回收率为103.8%、102.2%、99.7%，RSD分别为2.44%、2.69%、3.16%（n＝9）。结论：该方法准确、灵敏度高、专属性强、重复性好，可用于盐酸阿糖胞苷原料药的质量控制。

盐酸阿糖胞苷；尿嘧啶；尿苷；阿糖尿苷；超高效液相色谱法；含量测定

＊主管药师。研究方向：医院药学。电话：0371-65907512

#通信作者：主任药师，硕士。研究方向：药物分析。电话：0371-63388295。E-mail：wangxueqin2008@126.com

阿糖胞苷为嘧啶类抗代谢药，主要用于治疗急性粒细胞白血病及消化道肿瘤，是治疗白血病最常见的药物[1]。盐酸阿糖胞苷为阿糖胞苷的盐酸盐。美国药典（USP）、英国药典（BP）等均只收载阿糖胞苷原料药的检测质量标准[2-3]，而《中国药典》2010年版收载了盐酸阿糖胞苷（原料药）的检测质量标准[4]。BP收载的有关物质测定采用薄层色谱（TLC）法，含量测定采用非水滴定法；USP与《中国药典》收载的有关物质和含量测定均采用高效液相色谱（HPLC）法，但色谱条件有所不同。笔者参照了相关文献[5-9]，采用超高效液相色谱（UPLC）法同时对盐酸阿糖胞苷原料药中主成分和有关物质的含量进行测定，以为其质量控制提供参考。

1 材料

Acquity系列UPLC仪，包括四元梯度泵、自动进样器、光电二极管阵列检测器、Empower工作站（美国Waters公司）；XR205SM-DR电子天平（瑞士Precisa公司）。

盐酸阿糖胞苷、阿糖尿苷对照品（美国Sigma公司，批号：SLBB7397V、031M 5069V）；尿嘧啶、尿苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100469-200401、887-200202）；盐酸阿糖胞苷原料药（河南信心制药有限公司，批号：20120401、20120402、20120403、20120801、20120802、20120803）；甲醇为色谱纯，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：InertsilODS-3C18（4.6mm×150mm，5μm）；流动相：磷酸盐缓冲液（流动相A，含0.01mol/L磷酸二氢钠和0.01 mol/L磷酸氢二钠）-甲醇（流动相B），梯度洗脱程序见表1；流速：0.8m l/min；检测波长：254 nm；柱温：40℃，进样量：10μl。

2.2 溶液的制备

表1 流动相梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution ofmobile phase

2.2.3供试品溶液的制备 取样品0.05 g，置于10m l量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.2.4 空白对照溶液的制备 取不含盐酸阿糖胞苷的样品，按“2.2.3”项下方法制成空白对照溶液。

2.3 专属性试验

2.3.1 主成分含量测定的专属性考察 分别取“2.2”项下的对照品溶液、供试品溶液和空白对照溶液各10μl，分别注入UPLC仪，记录色谱，详见图1。由图1可见，空白对照对盐酸阿糖胞苷含量测定无干扰。

图1 超高效液相色谱图A.空白对照；B.对照品；C.供试品；1.尿嘧啶；2.盐酸阿糖胞苷；3.尿苷；4.阿糖尿苷Fig 1 UPLC chromatogram sA.blank control；B.substance control；C.test sample；1.uracil；2. cytarabine hydrochloride；3.uridine hydrochloride；4.1-β-D-arabino furanosyl-uracil

2.3.2破坏性试验（1）精密称取样品0.005 2 g，置于10m l量瓶中，加1mol/L盐酸溶液1m l，室温放置0.5 h，用1mol/L氢氧化钠溶液中和至中性，加水稀释至刻度，摇匀，备用；（2）精密称取样品0.005 5 g，置于10m l量瓶中，加1mol/L氢氧化钠1m l，室温放置0.5 h，用1mol/L盐酸溶液中和至中性，加水稀释至刻度，摇匀，备用；（3）精密称取样品0.005 3 g，置于10m l量瓶中，加30%过氧化氢1m l，室温放置0.5 h，加水稀释至刻度，摇匀，备用；（4）精密称取样品0.005 2 g，于105℃干燥6 h，置于10m l量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，备用；（5）精密称取样品0.005 1 g，于（4 500±500）lx条件下照射8 h，置于10m l量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，备用。精密量取上述5种溶液各10μl，分别注入UPLC仪，记录色谱，详见图2。由图2可见，本品在强酸、强碱、氧化、高温、光照条件下，样品均被破坏产生降解产物，所产生的降解产物在“2.1”项色谱条件下均能达到较好的分离。主峰与降解产物峰、各个杂质峰之间分离度均大于1.5。

图2 破坏性试验超高效液相色谱图A.酸破坏样品；B.碱破坏样品；C.氧化破坏样品；D.高温破坏样品；E.光照破坏样品；1.盐酸阿糖胞苷Fig 2 HPLC chromatogram s of treated testA.treated w ith acid；B.treated w ith alkali；C.treated w ith oxidation；D.treated w ith high temperature；E.treated w ith light；1.cytarabine hydrochloride

2.4 线性关系考察

取“2.2.1”项下4种对照品贮备液各0.4、0.2、0.1、0.05m l，分别置于10m l量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。按“2.1”项下色谱条件，分别取上述4种溶液10、5、3、2、1、0.5、0.3、0.1μl进样，记录色谱。以检测质量浓度（x，μg/m l）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归，回归方程和线性范围见表2。

表2 回归方程和线性范围Tab 2 Regression equation and linear range

2.5 检测限和定量限

取“2.2.2”项下对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱，以信噪比S/N＝3∶1计算盐酸阿糖胞苷、尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷的检测限，分别为3.00、1.008、3.018、2.868 ng；以信噪比S/N＝10∶1计算盐酸阿糖胞苷、尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷的定量限，分别为10.00、3.024、5.03、4.78 ng。

2.6 精密度试验

取“2.2.2”项下对照品溶液10μl，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，结果，尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷、盐酸阿糖胞苷的RSD分别为0.08%、0.28%、0.28%、0.54%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下对照品溶液适量，分别于放置0、1、2、3、5、6、10、15 h时进样测定。结果，尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷、盐酸阿糖胞苷的RSD分别为0.07%、0.25%、0.37%、0.65%，表明15 h内对照品溶液稳定性良好。

2.8 重复性试验

取样品（批号：20120401）适量，共6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定并计算各成分含量。结果，尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷均未检出，其它单杂（胞苷）的量平均为0.002%，RSD＝0.79%，表明本方法重复性良好。

2.9 有关物质加样回收率试验

精密称取样品（批号：20120401）共9份，每份约0.05 g，分别置于10m l量瓶中，精密加入“2.2.1”项下对照品溶液适量，加水稀释至刻度，摇匀，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定并计算加样回收率，结果见表3。

表3 有关物质加样回收率试验结果（n＝9）Tab 3 The average recoveries of related substances（n＝9）

2.10 样品含量测定

取6批样品适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，按外标法以峰面积计算含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果（%，n＝3）Tab 4 Results of content determ ination of sam p les（%，n＝3）

2.11 相对保留时间及相对校正因子的测定

2.12 样品有关物质测定

精密称取样品50mg，置于10m l量瓶中，加水溶解并稀释成每1m l含5mg的溶液，作为有关物质测定供试品溶液。取盐酸阿糖胞苷对照品适量，精密称定，用水溶解并定量稀释制成每1m l含5μg的溶液作为有关物质测定对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件，取上述对照品溶液10μl，注入UPLC仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%。再精密量取上述供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入UPLC仪，测定并计算盐酸阿糖胞苷的含量。结果，尿嘧啶峰、尿苷峰、阿糖尿苷峰对盐酸阿糖胞苷峰的相对保留时间分别为0.53、1.14、1.55，尿嘧啶峰、尿苷峰、阿糖尿苷峰对盐酸阿糖胞苷峰的相对校正因子分别为2.92、1.73、1.55；对盐酸阿糖胞苷峰的相对保留时间约为0.38、0.43的色谱峰的相对校正因子均为1.72，其他杂质峰的相对校正因子均按1.1计算。结果见表5。

表5 样品有关物质测定结果（%）Tab 5 Results of content determ ination of related substances in sam p les（%）

3 讨论

3.1 检测波长的选择

色谱图中可见尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷及盐酸阿糖胞苷的最大吸收波长分别为259.9、262.1、263.3和272.5 nm，但由于盐酸阿糖胞苷在254 nm波长处的吸收较强，既可以保证杂质的检出，又能够准确地测定主成分含量，故选择254 nm作为本方法的检测波长。

3.2 流动相的选择

笔者研究发现，流动相中0.01mol/L磷酸氢二钠和0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液的pH均为6.86，缓冲力较大，且较稳定。若将pH调至6.0或7.0，则需加入大量的稀酸或稀碱，不易控制，色谱峰易分叉。另外，由于本品黏度较大，重复多次进样后色谱柱上残留物不易洗脱干净，柱压不断升高，因此在梯度洗脱主成分和主要杂质出峰后，增加了甲醇的比例，有利于洗脱色谱系统中残留杂质，保持色谱条件的稳定。

3.3 色谱柱的选择

笔者曾尝试采用了3根不同品牌的C18色谱柱、两台不同型号的UPLC仪，分别在不同时间点采用本研究中的色谱条件进行测定。结果发现，Inertsil ODS-3 C18分离效果最好，无干扰，灵敏度高，且峰形较好。

3.4 样品的稳定性

在破坏性试验中均检出了尿嘧啶和尿苷，加速试验和长期试验中均检出了阿糖尿苷。盐酸阿糖胞苷对温度较敏感，可在放置过程中降解产生阿糖尿苷。因此，在贮藏时应注意温度对样品质量的影响。

综上所述，本方法准确、灵敏度高、专属性强、重复性好，可作为盐酸阿糖胞苷原料药的质量控制方法。

[1] 李莉霞，唐跃年.阿糖胞苷抗白血病药理作用及耐药机制的研究进展[J].中国药房，2006，17（19）：1 506.

[2]British Pharmacopoeia Comm ission.BP2013[S].2012：631.

[3]The United States Pharmacopoeia Convention.USP35-NF30[S].2012：2 800.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部[S.]2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：716.

[5]左英熹，李良，卢炜，等.高效液相色谱法测定体内脱氧核糖核酸结合的阿糖胞苷浓度[J].中国医院药学杂志，2008，28（9）：718.

[6]张虹，方昱，李英，等.高效液相色谱法测定细胞内三磷酸阿糖胞苷的浓度[J].中国医院药学杂志，2010，30（18）：1 564.

[7] 梁蔚阳.高效液相色谱法测定阿糖胞苷注射液中有关物质的含量[J].药物生物技术，2009，16（5）：460.

[8]林焕泽，蓝忠，杨华，等.反相高效液相色谱法测定注射用盐酸阿糖胞苷的有关物质[J].中国药业，2009，18（15）：27.

[9]许双临，陈子春，林宇涵，等.大剂量阿糖胞苷治疗时血浆阿糖胞苷及阿糖尿苷的HPLC测定方法.[J].海峡药学，2013，25（7）：128.

Simultaneous Determ ination of Cytarabine Hydrochloride and Related Substances by UPLC

HAILi-ping1，YANG Dong-jing2，WANG Zhi-yuan3，WANG Xue-qin4（1.First Outpatient Department，Departments Directly under Henan Province，Zhengzhou 450003，China；2.Medical College of Henan University，Henan Kaifeng 475001，China；3.Pharmaceutical College of Henan University，Henan Kaifeng 475001，China；4.Henan Institute for Food and Drug Control，Zhengzhou 450003，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of cytarabine hydrochloride and related substance.METHODS：UPLCmethod was adopted.The determination was performed on Inertsil ODS-3 C18column w ithmobile phase consisted of phosphate buffer-methanol（gradient elution）at the flow rate of 0.8 m l/min；the detection wavelength was set at 254 nm and the column temperature was 40℃.The sample size was 10μl.RESULTS：The liner ranges were 0.100 8-20.16μg/m l for uracil（r＝0.999 9），0.1-20.12μg/m l for uridine（r＝0.999 8），0.095 6-19.12μg/m l for 1-β-D-arabino furanosyl-uracil（r＝0.999 9）and 0.1-20.004μg/m l for cytarabine hydrochloride（r＝0.999 9），respectively.RSD of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 0.79%；average recoveries of uracil，w ridine and 1-β-D-arabino furanosyl-uracil were 103.8%（RSD＝2.44%，n＝9），102.2%（RSD＝2.69%，n＝9）and 99.7%（RSD＝3.16%，n＝9）.CONCLUSIONS：Themethod is accurate，sensitive，specific and reproducible，and can be used for the quality control of cytarabine hydrochloride.

Cytarabine hydrochloride；Uracil；Uridine；1-β-D-arabino furanosyl-uracil；UPLC；Content determination

R917

A

1001-0408（2014）12-1137-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.12.28

2013-12-14

2014-1-13）

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