氧化型低密度脂蛋白对正常人外周血单核细胞凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1及尿激酶型纤溶酶原激活剂受体蛋白表达的影响

焦珍珍，方全 ，黄建凤

氧化型低密度脂蛋白对正常人外周血单核细胞凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1及尿激酶型纤溶酶原激活剂受体蛋白表达的影响

焦珍珍，方全 ，黄建凤

目的： 探讨不同时间点不同浓度氧化型低密度脂蛋白（ oxLDL）对正常人外周血单核细胞凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）、尿激酶型纤溶酶原激活剂受体（uPAR）蛋白的表达情况的影响。

方法： 选取正常人外周血经Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC），用含20%自体血清的RPMI1640完全培养基培养，收取其帖壁的单核细胞，以免疫印迹杂交法（Western Blot）方法检测不同浓度oxLDL对正常人单核细胞干预24h，72h的uPAR、LOX-1的蛋白表达。

结果： oxLDL干预正常人单核细胞24小时后，随着其浓度的增加uPAR及LOX-1蛋白表达上调，在50 μg/ml时达峰，而高浓度组（100 μg/ml）对两者的蛋白表达起着抑制作用。oxLDL刺激正常人单核细胞72小时后，低浓度（10 μg/ml）不能有效地增加uPAR的表达，较高浓度（50 μg/ml、100 μg/ml）能够较有效地增加uPAR的表达。oxLDL刺激正常人单核细胞72小时后，LOX-1的表达随着浓度的增加而上调，但浓度≥50 μg/m l时，其表达有所下降。

结论： 本研究中oxLDL不同作用时间对uPAR及LOX-1的影响不同，提示了oxLDL致炎症过程的复杂性。

氧化低密度脂蛋白；尿激酶型纤溶酶原激活剂；凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:288.)

氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）在心血管疾病的发生发展中有着重要的作用，它参与动脉粥样硬化病变的发生发展是较为明确的[1]，主要通过两种机制促进动脉粥样硬化的发展：一是单核巨噬细胞通过清道夫受体摄入oxLDL，引起血管壁泡沫细胞的堆积和脂纹的形成；二是oxLDL改变了内皮细胞的多种功能，如诱导内皮表达黏附分子、血管平滑肌生长因子、集落刺激因子以及单核细胞化学趋化蛋白-1等，同时还通过降低一氧化氮（NO）的产生而减弱内皮依赖性舒张反应。尿激酶型纤溶酶原激活剂受体（uPAR）最早被Vassalli和Stoppelli等在人类外周血的单核细胞中发现。它广泛存在于多种细胞表面，如外周血白细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞、成纤维细胞及骨髓细胞等，此外还可表达于多种肿瘤细胞表面。凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）是一种在内皮细胞丰富表达的Ⅱ型单链跨膜蛋白，属C型选择素家族，在单核细胞，巨噬细胞，血小板，平滑肌细胞也有表达。oxLDL可通过与内皮细胞表面的LOX-1结合激活内皮，影响内皮功能，损伤血管，参与动脉粥样硬化的进展。LOX-1具有对oxLDL的特异性结合、内吞以及降解作用，但是对天然的及乙酰化的低密度脂蛋白（LDL）无此作用。LOX-1与oxLDL之间的特异性结合可以被多聚肌苷酸和角叉菜胶抑制[2]。活化的单核细胞在动脉粥样硬化的病理机制中发挥着重要的作用[3]。单核细胞需粘附到血管壁、迁移至炎症灶的局部，才能发挥致炎症的潜力。在这一复杂过程中，需要粘附分子的受体及其复合受体参与，如uPAR和LOX-1[4]。在oxLDL活化单核细胞的过程中，uPAR与LOX-1表达均会有改变。本研究旨在探讨oxLDL对正常人外周血单核细胞中uPAR及LOX-1的蛋白水平的影响。

1 对象和方法

研究对象的收集：正常人来自2010-11到2011-03招募的健康志愿者，条件符合以下标准：①年龄≥18岁；②无2型糖尿病及动脉粥样硬化性疾病；③肝肾功能正常；④无肿瘤等恶性疾病史；⑤血脂代谢正常；⑥无感染性疾病风湿免疫性疾病等。上述健康志愿者签署知情同意书。空腹12小时以上，严格无菌条件下抽取外周血200 m l，分别置于9 m l依地酸二钠（EDTA）抗凝管中充分混匀，取血6小时内在无菌条件下进行以下操作。

人外周血单个核细胞的分离及培养：①全血静置后以1500 r/min离心10 min，去血浆；②以3倍D-Hank’s稀释血细胞形成混合液；③将混合液缓慢叠加于淋巴细胞分离液之上（两者体积比2：1）；④2000 r/min 离心30 min,可见4层，从上至下取第二层（白色云雾状），纯化、计数；⑤接种于6孔板以RPMI1640+20%自体血清+双抗培养液培养；⑥6小时后以不同浓度oxLDL干预，分别于24h、72h收取贴壁的单核细胞提取蛋白质。

免疫印迹杂交法（Western blot）：①RIPA裂解液制备细胞总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（Biomed）测定蛋白含量；②聚丙烯酰氨凝胶制备，上样与电泳，转膜，封闭，结合一抗，洗涤，结合二抗，电化学发光（ECL）显影，半定量分析。

统计学处理：运用SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差表示，两浓度之间比较采用t检验，P＜0.05则有统计学意义。

2 结果

Western blot检测发现，经oxLDL干预24小时（图1、2），随着oxLDL浓度的增加，uPAR及LOX-1的蛋白表达呈上升趋势；当oxLDL为10 μg/m l、20 μg/m l、50 μg/m l刺激外周血单核细胞后uPAR及LOX-1蛋白表达水平较0 μg/m l显著升高（P＜0.05），且3个浓度之间的表达差异有统计学意义；50 μg/m l的oxLDL对uPAR及对LOX-1表达刺激最为明显，相对于其他浓度组亦有明显的促进作用（P＜0.05）；oxLDL 浓度为 100 μg/m l时，对 uPAR和对LOX-1蛋白表达呈抑制趋势，与0 μg/m l和50 μg/m l比较差异有统计学意义 （P＜0.05）；多聚肌苷酸（polyi）对LOX-1蛋白表达有着较明显的抑制作用，差异有统计学意义（P＜0.05），多聚肌苷酸对uPAR的表达则未见抑制作用。

经oxLDL干预72小时（图3、4），当oxLDL为10 μg/m l 时不能有效增加 uPAR 的表达，50 μg/ml、100 μg/m l刺激外周血单核细胞后uPAR蛋白表达水平较oxLDL 0 μg/ml显著升高 （P＜0.05），10 μg/ml、20 μg/m l、50 μg/m l、100 μg/ml浓度之间的表达差异均有统计学意义（P＜0.05）；100 μg/m l的oxLDL对uPAR表达刺激最为明显，相对于其他浓度组亦有明显的促进作用（P＜0.05）； oxLDL 浓度为 10 μg/m l、20 μg/m l时，对LOX-1蛋白表达呈上升趋势，差异有统计学意义 （P＜0.05）；50 μg/m l 表达有所下降，但与oxLDL 0 μg/m l 比较差异仍有统计学意义。polyi对uPAR和LOX-1蛋白表达均有着较明显的抑制作用（P＜0.05）。

图1 24小时uPAR蛋白表达情况

图2 24小时LOX-1受体表达

图3 72小时uPAR蛋白表达情况

图4 72小时LOX-1受体表达

3 讨论

动脉粥样硬化是发达国家人口的主要死亡原因[5]，也是心血管疾病共同的病理基础。1999年初，Ross等[6]提出动脉粥样硬化是发生在大血管及中血管的一种慢性炎症。炎症是动脉粥样硬化病变的基础病理变化，目前已有许多的炎性因子被研究证实参与了冠心病的发生和发展，uPAR和LOX-1亦是其中之一[7-9]。本研究应用正常人外周血单核细胞作为研究对象，结果发现单核细胞经过不同浓度的oxLDL干预以后，uPAR及LOX-1的蛋白表达有所区别。由图1可看出：不同浓度的oxLDL干预正常人外周血单核细胞24小时后，uPAR的表达随着浓度的升高表达上调，在50 μg/m l时达到峰值，100 μg/ml较前一组表达反而下降，polyi与 50 μg/m l相比，uPAR表达上调。由图2可看出：不同浓度的oxLDL干预正常人外周血单核细胞24小时后，LOX-1的表达随着浓度的升高而上调，在50 μg/m l时达到峰值，100 μg/m l较前一组表达反而下降，polyi与50 μg/ml相比，LOX-1表达下调。由图3可看出：不同浓度的oxLDL干预正常人外周血单核细胞72小时后，10 μg/m l浓度组较 0 μg/m l表达下调，20 μg/ml与0 μg/m l表达基本一致，之后表达开始上调，在100 μg/m l达峰。Polyi较 50 μg/m l表达下调。由图 4可看出：不同浓度的oxLDL干预正常人外周血单核细胞 72 小时后，10 μg/m l、20 μg/ml较 0 μg/m l表达上调，20 μg/ml时达峰，50 μg/m l时较 20 μg/ml下调，在 100 μg/m l时与 0 μg/m l基本相似。Polyi组较 50 μg/m l表达下调。

采用Western blot方法的研究结果显示50 μg/ml的oxLDL对uPAR及LOX-1的蛋白表达刺激最为明显，相对于其他浓度组亦有明显的促进作用（P＜0.05），提示oxLDL可能影响uPAR及LOX-1的表达参与炎症反应、进而参与动脉粥样硬化进展。研究发现[10]：不同浓度的oxLDL干预人冠状动脉内皮细胞过程中，LOX-1的表达呈现浓度依赖性，在40 μg/m l表达最高，100 μg/m l呈现抑制。国内[11,12]也有研究显示，在巨噬细胞中，oxLDL干预下LOX-1表达的达峰浓度为75 μg/m l，随后表达下降。本研究中，LOX-1表达的峰值浓度为50 μg/m l，与国内外既往的研究结果相近。oxLDL以浓度依赖性的方式刺激LOX-1的表达上调，而且oxLDL与LOX-1结合后可使巨噬细胞吞噬oxLDL的能力进一步加强，说明在oxLDL介导的机体损伤中，uPAR和LOX-1一样，在早期即显示出生物学作用，但具体表现为防御性保护作用还是损伤作用，尚无法定论。oxLDL浓度为100 μg/m l时，对uPAR和LOX-1蛋白表达呈抑制趋势，差异有统计学意义（P＜0.05），oxLDL高浓度时对uPAR及LOX-1的抑制作用，其生物机制有待后续研究；Polyi作为LOX-1的抑制剂，特异性地抑制LOX-1 表达[13]。

对于uPAR的表达，在72小时与24小时相比而言，10 μg/m l组表达较 0 μg/m l下调，并且oxLDL对于uPAR表达的刺激作用的浓度峰值后移，可能显示了低浓度的oxLDL时可能机体呈现出短期防御性细胞免疫保护的过程，而大于20 μg/m l才是真正损伤的浓度范围。两个时间点比较而言，峰值后移说明长时程（72小时）方可显现真正的损伤的因素。

本研究仍存在一定的局限性。比如，所购买的oxLDL为人工合成，与人体内的表达产物功能上还是有一定差异。在原代单核细胞进行培养的过程中，虽然尽量模拟体内生理状态，予以刺激仍可能会导致细胞表型的部分改变及某些基因和蛋白的激活。本研究未显示时间依赖性的刺激表达结果及相关功能实验结果，需要今后进一步的研究证实。

综上所述，oxLDL干预正常人外周血单核细胞24小时后，随着其浓度的增加uPAR及LOX-1蛋白表达上调，在50μg/m l时达峰，而高浓度组（100 μg/ml）对两者的蛋白表达起着抑制作用。oxLDL刺激正常人单核细胞72小时后，低浓度（10 μg/ml、20 μg/m l）不能有效地增加uPAR的表达，较高浓度（50 μg/m l、100 μg/m l）能够较有效地增加 uPAR 的表达；而LOX-1的表达随着oxLDL浓度的增加先上调后又下降。该结果提示oxLDL不同作用时间对uPAR及LOX-1的影响不同，提示了oxLDL致炎症过程的复杂性。oxLDL参与动脉粥样硬化进程的生物机制还需今后近一步研究。

[1] Kiyan Y, Tkachuk S, H ilfiker-Kleiner D, et al. oxLDL induces inflammatory responses in vascular smooth muscle cells via urokinase receptor association with CD36 and TLR4. J Mol Cell Cardiol, 2013,66c： 72-82.

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[11] 何军, 马业新. 氧化型低密度脂蛋白促进巨噬细胞血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1表达及辛伐他汀干预研究. 中国医师杂志 , 2007, 9： 753-756.

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（编辑：汪碧蓉）

Effect of Oxidative LDL on Protein Expressions of Lectin Like Oxidized LDL Receptor-1 and Urokinase Type Plasm inogen Activator Receptor in Normal Human Peripheral Blood M ononuclear Cells

JIAO Zhen-zhen, FANG Quan, HUANG Jian-feng.
Department of Functional Testing, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

HUANG Jian-feng, Email: jianfhuang@sina.com

Objective: To investigate the effect of oxidative LDL (oxLDL) on protein expressions of lectin like oxidized low density lipoprotein receptor-1 (LOX-1) and urokinase type plasm inogen activator receptor (uPAR) in normal human peripheral blood mononuclear cells (PBMC).

Methods: The normal human PBMC was isolated by Ficoll-paque density gradient centrifugation and cultured w ith RPM I 1640 medium w ith 20% antologous serum. Western blot was conducted to detect the effect of oxLDL at different concentrations and time periods on protein expressions of LOX-1 and uPAR in normal human PBMC.

Results: For 24-hour oxLDL treatment, the protein expressions of uPAR and LOX-1 were increased w ith the elevated oxLDL concentrations, oxLDL 50 μg/m l was the peak, while the expressions were inhibited by oxLDL 100 μg/m l. With 72-hour oxLDL treatment, the low concentration of oxLDL 10 μg/m l could not increase uPAR protein expression, while oxLDL 50 μg/m l and 100 μg/m l could effectively increase uPAR protein expression; the LOX-1 expression was increased according to the elevated oxLDL concentrations, while the expression decreased at oxLDL ≥50 μg/m l.

Conclusion: Our work indicated that different concentrations and time periods of oxLDL treatment may affect the protein expressions of uPAR and LOX-1 at different degrees which suggested that oxLDL-induced inflammatory process was complicated.

Oxidative LDL; Lectin like oxidized low density lipoprotein receptor-1; Urokinase type plasm inogen activator receptor

100037 北京市，中国医学科学院 北京协和医学院 心血管病研究所 阜外心血管病医院 功能检测中心（焦珍珍、黄建凤），中国医学科学院 北京协和医学院 心内科（方全）

焦珍珍 住院医师 硕士 主要从事冠心病的发病机制的相关研究 Email：jiaozz789@126.com 通讯作者：黄建凤 Email：jianfhuang@sina.com

R54

A

1000-3614( 2014 ) 04-0288-04

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2014.04.013

2013-09-25）

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