高效液相色谱法测定注射用盐酸瑞芬太尼有关物质

杨 争,戎晓娟,曹俊涵,马玉洁,李诗草,杨 红

（1.中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所，四川 成都 610052；2.成都市食品药品检测中心，四川 成都 610045）

高效液相色谱法测定注射用盐酸瑞芬太尼有关物质

杨 争1,戎晓娟1,曹俊涵2,马玉洁1,李诗草1,杨 红1

（1.中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所，四川 成都 610052；2.成都市食品药品检测中心，四川 成都 610045）

建立高效液相色谱法测定注射用盐酸瑞芬太尼的有关物质，色谱柱采用Kromasil氰基柱，流动相为0.03mol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.0）-甲醇-乙腈（80∶16∶4），检测波长225nm。盐酸瑞芬太尼在0.5046～1009.2μg/mL范围内与杂质峰面积显示有良好的线性关系（r=0.9999），最低检出限为0.001μg。该法简便、准确，专属性强，可用于注射用盐酸瑞分太尼有关物质测定。

盐酸瑞芬太尼；高效液相色谱；测定

0 引 言

盐酸瑞芬太尼（remifentanil hydrochloride）是一种由酯酶代谢的强效阿片受体激动剂，其作用起效迅速且极快消失，给药剂量小，半衰期短，已逐渐成为镇痛性麻醉药市场上销售份额最大的品种。目前，盐酸瑞芬太尼及注射用盐酸瑞芬太尼尚未被国内外药典收载，国内国家药品标准有收载[1]，但有关物质的分析方法文献未见报道。国外文献报道大多是有关药代动力学方面研究测定生物样品中盐酸瑞芬太尼的HPLC方法[2-5]，由于原国家药品标准中注射用盐酸瑞芬太尼有关物质检查方法主峰保留较小，各峰之间分离度差，本文经研究改进建立的HPLC法测定注射用盐酸瑞芬太尼的有关物质，分离度高，准确性好，能很好地用于控制本品质量。

1 仪器与试药

LC-20AB型高效液相色谱仪，包括LC-20AB型泵，SPD-20A型紫外检测器，SIL-20AC型自动进样器，LC-solution色谱工作站（日本岛津）。

盐酸瑞芬太尼对照品（中国药品生物制品检定所，105℃干燥2 h后使用，含量100.0%，批号171260-200601）。注射用盐酸瑞芬太尼（四川抗菌素工业研究所制备），规格1mg。甲醇、乙腈均为色谱纯，磷酸二氢钾为分析纯，水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

供试品溶液：取本品，加流动相稀释制成每1mL中约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液。

对照溶液：精密量取供试品溶液适量，加流动相制成每1mL中约含10.0μg的溶液，作为对照溶液。

2.2 色谱条件与测定法

色谱柱Kromisil氰基柱（4.6mm×250mm×5μm）；流动相0.03 mol/L磷酸二氢钾溶液（以磷酸调至pH 3.0）-甲醇-乙腈（80∶16∶4）；检测波长225 nm；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量20μL。

系统适用性试验。取瑞芬太尼对照品5mg，置10mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，取此溶液2mL，加2滴0.5mol/L氢氧化钠溶液，在25℃放置10min后，加2滴0.5mol/L盐酸溶液中和，摇匀，作为系统适用性试验溶液，取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图。理论板数按瑞芬太尼峰计算应不低于3000；主要色谱峰的出峰顺序为杂质A、瑞芬太尼。瑞芬太尼峰与杂质A峰（相对保留时间约为0.82～0.88的）的分离度应大于3.0。

测定法。取本品，加流动相稀释制成每1mL中约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；再精密量取适量，加流动相制成每1mL中约含10.0μg的溶液，作为对照溶液；取对照溶液20 μL，调节检测灵敏度，使主成分峰的峰高约为满量程的20%。精密量取供试品溶液与对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，除辅料峰外，单个杂质峰的峰面积不得大于对照溶液的主峰面积（2.0%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2.5倍（5.0%）。

2.3 专属性试验

2.3.1 空白辅料分离试验

取本品及空白辅料，照2.2项下的色谱条件测定，空白辅料峰与主峰完全分离，辅料不干扰测定，其结果见图1、图2。

2.3.2 强烈因素破坏试验

取注射用盐酸瑞芬太尼1mg规格一瓶，分别进行高温、酸、碱和氧化破坏，然后按“2.1”项下供试品溶液配制方法处理，进样测定。结果见图3，在相对保留时间为0.86处有一主要降解杂质（简称A），主峰与降解杂质峰能达到有效分离，样品对强光破坏较稳定，未见明显杂质增加。

2.4 线性试验

运用热破坏样品进行线性关系试验，选用高温破坏的注射用盐酸瑞芬太尼样品考察杂质峰面积（杂质A，相对保留时间为0.86）与进样浓度之间的线性关系。取热破坏样品适量置于容量瓶中，加流动相溶解并稀释制成0.5046，5.046，25.23，50.46，100.92，252.3，302.3，403.7，504.6，605.5，807.4，1 009.2 μg/mL系列溶液，进样体积20 μL，记录色谱图。以图3中峰3的面积A对供试品浓度C（μg/mL）进行线性回归，得回归方程为：A=525262C-1090.7。供试液浓度在0.5046～1 009.2 μg/mL范围内与杂质A的峰面积显示有良好的线性关系，其相关系数达0.9999。

2.5 检出限

将注射用盐酸瑞芬太尼有关物质检查浓度为0.5mg/mL时，有关物质（和降解产物）可检出的最低含量为0.01%，最小检出量（进样体积20 μL计算）为0.001μg。

2.6 精密度

2%自身对照溶液重复性试验：精密称取本品，加流动相制成每1mL中约含10.0μg的溶液，制成2%对照溶液；取此溶液，分别进样6次，按主峰面积计算对照溶液连续进样的RSD为0.26%，方法的重复性符合要求，且2%对照溶液的峰面积在6℃放置19h后测定，主峰面积无明显变化，说明样品溶液可稳定19h。

对同一批号样品不同日期称量，不同仪器，不同操作人员按有关物质检查方法测定，进行中间精密度试验，结果见表1，由于杂质含量很低，所以相对标准偏差较大，但检查方法的精密度能满足本品有关物质限度检查的要求。

2.7 供试品溶液稳定性

将供试品溶液在25℃下放置，分别于0，0.5，1，2，3，4，6h取样，进样测定，记录色谱图。结果在放置6h时，主要单个杂质峰面积增大近2倍，说明测定时供试品溶液较不稳定，宜临时新配。

取注射用盐酸瑞芬太尼，按“2.2”项下方法进行有关物质检查，结果见表2，说明样品中存在杂质含量低，纯度高，符合质量标准要求。

3 讨 论

3.1 流动相配比选择

甲醇、乙腈分别单独与磷酸盐缓冲液配比，以及这两种有机溶剂混合与磷酸盐缓冲液组成的流动相，进行样品的HPLC杂质分析，综合比较发现两种有机溶剂混合的分离效果更好。对不同比例有机溶剂配比进行试验，结果表明有机溶剂比例偏大导致主峰前的两个杂质峰重叠，不能分离。

3.2 流动相缓冲溶液pH的选择

考察流动相在pH为2.5，3.0，4.0，5.0，6.5时，主峰与杂质峰的分离结果表明，pH 6.5流动相配制的供试品溶液不稳定；pH 5.0时主峰分叉不对称；pH

2.5和pH 3.0时分离的杂质峰顺序、个数、大小都基本一致。综合考虑，选择pH 3.0。

3.3 检测波长选定及主峰纯度考察

智慧乡村是农业、农村智能化建设的重要路径之一，代表着我国乡村未来发展的新方向。智慧乡村作为一种新兴的概念体，是以现代化的互联网技术为依托，提高农村地区生产力水平，改善人地关系，以提高农民的生活水平和建立智能化文化、产业价值体系为目标，打造以休闲旅游、文化体验、农耕养殖等多种生产生活方式的新农村，使农村地区的生产生活方式处于“智慧”的状态。智慧乡村的建设已成为广大农村地区干部群众的迫切需求和期待，将在乡村发展中发挥重要作用。

将高温破坏样品在200～400 nm波长范围进行DAD二极管阵列紫外扫描检测，结果表明主成分与杂质A的末端吸收较大，在210～235nm范围都有相似的紫外吸收谱。样品主峰的纯度因子为999.960。

样品在波长215，220，225和230nm处测定的有关物质测定峰个数相差不大，考虑215nm低波长处溶剂峰干扰较大，因此测定波长选225nm为宜。

3.4 注射用盐酸瑞芬太尼的有关物质定性

国外文献[2-3]中有提到瑞芬太尼在体内降解或代谢过程中形成去甲氧基化合物（GI90291）和N-脱烷基化合物（GI94219）。在注射用盐酸瑞芬太尼的质量及稳定性研究中发现，样品的HPLC谱图显示存在3个杂质峰，有一主要杂质峰（简称杂质A）相对保留时间为0.86，杂质A与酸碱破坏产生的主要杂质峰保留时间一致，是一个降解杂质。为了确证杂质A的结构，通过碱降解破坏得到杂质A，再经分离纯化后获得纯度大于98%（色谱纯度）的杂质A，进行氢谱、碳谱确定为4-（甲氧基羰基）-4-[（1-氧代丙基）苯胺基]-1-哌啶丙酸[6]，即为文献报道的去甲氧基化合物（GI90291）。

3.5 有关物质测定自身对照法确定

注射用盐酸瑞芬太尼的主要单个杂质为杂质A，但杂质A对照品无法购买，经制备获取少量杂质A，试验测出杂质A相对校正因子为0.939。因此按2010年版中国药典附录XI X F药品杂质分析指导原则规定[7]，“已知杂质或毒性杂质对主成分的相对校正因子在0.9～1.1的范围内时，可以用主成分的自身对照法计算含量，超出0.9～1.1的范围时，宜用对照品对照法计算含量”。又通过对杂质对照品和自身对照法进行样品有关物质检查比较试验，其结果基本一致。在不影响测定结果的前提条件下，为避免制备杂质对照品的繁琐，使方法快速、简便，因此注射用盐酸瑞芬太尼的有关物质测定方法选用不加校正因子的主成分自身对照法[8-9]。

4 结束语

通过上述各项试验表明，经色谱条件优化的注射用盐酸瑞芬太尼有关物质HPLC检查方法，对样品存在的有关物质和降解产物，以及与主成分之间各峰均有很好的分离度。记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，足以完全检查产品中可能存在的杂质，有效改进了原国家药品标准注射用盐酸瑞芬太尼有关物质检查方法杂质之间分离较差的现象。本方法满足中国药典注射用盐酸瑞芬太尼产品中杂质（有关物质和降解产物）检查要求，对于更好地控制样品中有关物质具有较高的灵敏度和准确性，亦可作为本品稳定性研究中降解产物含量变化测定的有效方法。

[1]WS1（X-008）—2008Z注射用盐酸瑞芬太尼[S].北京：国家食品药品监督管理局，2008.

[2]Kabbaj M，Varin F.Simultaneous solid-phase extraction combined with liquid chromatography with ultraviolet absorbance detection for the determination of remifentanil and its metabolite in dog plasma[J].J Chromatogr B，2003（783）：103-111.

[3]Haidar S H，Liang Z M.Determination of remifentanil, an ultra-short-acting opioid anesthetic，in rat blood by high performance liquid chromatography with ultraviolet detection[J].J Pharm Biomed Anal，1996（14）：1727-1732.

[4]Bossu E，Montinaroa A.LC-MS Determination of remifentanilin maternal and neonatal plasma[J].Journalof Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2006（42）：367-371.

[5]Bender J，Elshout J.Determination of remifentanil in human heparinised whole blood by tandem mass spectrometry with short-column separation[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，1999（21）：559-567.

[6]马玉洁，杨红，戎晓娟，等.盐酸瑞芬太尼有关物质的HPLC法测定[J].中国医药工业杂志，2012，43（3）：204-207.

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版 二部附录ⅪX F：204[S].北京：中国医药科技出版社，2010.

[8]赵高峰，张兴安，吴群林，等.HPLC-UV测定人血浆瑞芬太尼浓度[J].中国药学杂志，2005，40（10）：783-785.

[9]单国瑾，吴新民，贡素宣，等.高效液相色谱法测定人全血中瑞芬太尼浓度[J].中国医院药学杂志2004，24（2）：67-68.

Determination of related substances in remifentanil hydrochloride for injection by HPLC

YANG Zheng1，RONG Xiao-juan1，CAO Jun-han2，MA Yu-jie1，LI Shi-cao1，YANG Hong1
（1.Sichuan Industrial Institute of Antibiotics of China National Pharmaceutical Group Corporation，Chengdu 610052，China；2.Chengdu Center of Food and Drug Control，Chengdu 610045，China）

A HPLC method wasestablished forthe determination ofrelated substancesin remifentanil hydrochloride.A Kromisil-CN column was used，with the mobile phase of 0.03 mol/L potassium dihydrogen phosphate-methol-acetonitrile （80∶16∶4）and the detecting wavelength of 225 nm.The calibration curve was linear in the concentration range of 0.5046-1 009.2 μg/mL（r= 0.999 9）.And the limit of detection was 0.001 μg.The method is simple，accurate and specific，and it can be used for determining related substances in remifentanil hydrochloride for injection.

remifentanil hydrochloride；HPLC；determination

R971+.2；TQ460.7+2；O657.7+2；TQ463+.3

：A

：1674-5124（2014）04-0056-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2014.04.014

2013-07-17；

：2013-09-18

“重大新药创制”科技重大专项（No2011ZX09401-403-8）

杨 争（1965-），男，四川成都市人，工程师，主要从事药物制剂和分析研究工作。