肺结核患者痰标本分枝杆菌培养方法分析

闫晓琳

肺结核是结核分枝杆菌引起的肺部慢性传染性疾病。结核菌属分枝杆菌属, 对人类致病主要是人型菌, 其次为牛型菌, 具有抗酸染色的特性。结核菌素试验是判断机体是否感染过结核分枝杆菌的主要手段, 结核菌素强阳性反应提示机体处于结核超敏感状态［1］。选取2012年6月～2013年6月60例肺结核患者痰标本进行快速培养系统检测提高结核分枝杆菌的检出率。

1 材料与方法

1.1 标本来源 肺结核患者60例痰标本均来自本院住院患者。其中男38例, 女22例, 年龄8～83岁, 平均34岁。

1.2 痰标本前处理 ①酸处理法：用于碱性L-J培养基。取痰标本数毫升, 根据黏稠度的不同, 加入2～4倍量的2%～4%H2SO4, 振荡, 混匀, 放室温处理20 min, 其间振荡2～3次, 促进液化。②碱处理法：用于酸性L-J培养基。取痰标本数毫升, 根据黏稠度的不同, 加入2～4倍量2%～4%NaOH, 振荡器振荡5～10 min或置室温30 min, 其间振荡2～3次促进液化。③胰蛋白酶、新洁尔灭法：痰标本加入等量或倍量0.1%胰蛋白酶溶液, 振荡至消化均匀, 加入半量以杀灭杂菌的0.3%新洁尔灭, 混匀放置室温5 min。注意新洁尔灭与标本接触勿超过5 min。④NaOHNALC法：试剂配置：2.94%(0.1 mol/L)枸橼酸钠溶液50 ml, 加4%NaOH溶液50 ml, 混匀, 临用前加入0.5 g NALC, 因该溶液不稳定, 应密闭冷藏且当日内使用。处理方法：取痰标本1 ml放入50 ml离心管内, 加等量消化液, 振荡混匀, 静置20 min。加灭菌的浓度为0.067 mol/L的pH 6.8磷酸盐缓冲液至50 ml刻度处混匀, 3000 r/min, 离心20 min, 弃去上清。

1.3 接种 将培养基置温箱预温30 min(罗氏培养基或其他固体结核培养基)。于无菌室内用毛细管取标本约0.1 ml, 接种于培养基斜面, 使其沿斜面铺盖。封严管口, 将试管平置, 使斜面呈水平位15～20 min, 移入37℃培养, 如采用4%NaOH处理则应用硫酸中和后接种。

1.4 结果观察 培养基接种标本以后, 每周由温箱观察1次, 有菌落生长时, 可报告。分枝杆菌培养阴性(-)斜面无菌生长, 分枝杆菌培养阳性(+)菌落占斜面面积的1/4, 分枝杆菌培养阳性(++)菌落占斜面面积的1/2, 分枝杆菌培养阳性(+++)菌落占斜面面积的3/4, 分枝杆菌培养阳性(++++)菌落布满全斜面, 菌落占斜面面积不足1/4者实报菌落数。必要时做涂片染色, 生化鉴定、菌型鉴定、动物实验等。至第8周未生长时可报告“培养8周无结核分枝杆菌生长”。在观察分枝杆菌生长情况时, 发现有非分枝杆菌的生长,报告污染, 重新送检。

2 结果

痰涂片抗酸染色镜检, 阳性23例, 阳性率38.33%。

3 讨论

分枝杆菌的培养和一般细菌不同, 营养要求比较高, 如需要氧、碳、氮、氨基酸、无机盐类(磷、钾、镁、铁等)、生长素(烟酸、核黄素及来自卵黄、血液的某些成分)等。常用的培养基用氨基酸、甘油及无机盐等成分配制基础液, 再加鸡蛋液混匀凝固而形成固体培养基。分枝杆菌培养的目的是增加分枝杆菌生长率, 提高阳性率, 为结核病的诊断提供最可靠的证据；活菌可用于药物敏感性测定, 指导临床药物治疗；活菌可用于菌种鉴定, 为结核病与非结核性分枝杆菌病鉴别诊断提供依据；活菌可用于毒力测定；用于流行病学调查, 明确传染源, 确定预防措施［2］；某些通过检测细菌生长早期代谢物达到快速鉴定细菌目的的新方法仍属培养范畴。

标本前处理是利用分枝杆菌细胞壁的高脂质成分具有较强抗酸、碱作用的特性, 在培养接种前将标本用强酸或强碱加以处理, 其目的是杀灭或抑制杂菌的生长, 溶解黏液、脓汁、蛋白, 将被包裹的分枝杆菌释放出来, 提高检出率。

培养基一般放冰箱(2～8℃)避光保存。为了防止培养基失去凝固水, 可采用螺旋试管分装培养基, 并将试管装入塑料袋中封口保存。必要时对培养基进行抽样生长试验, 接种标准菌株(H3TRy)10-3mg湿菌, 4周内有菌落生长者方可, 否则为质量不合格。污染率应控制在2%以下, 当污染率高于2%时, 提示培养基污染或消化处理不当。应采取相应措施。

［1］ 刘志辉, 罗鲁.结核病实验室诊断现状及展望.中国防痨杂志, 2003,25(3):38-40.

［2］ 张卫红, 石胜, 黄小霞, 等.综合医院与结核病防治所痰涂片抗酸杆菌检出率比较.中国基层医学, 2004,11(6):700.