壮医针挑疗法对哮喘模型小鼠TSLP mRNA及 IL-4、IL-5、IL-13 的影响*

唐汉庆 窦锡彬 李克明 李晓华 朱晓莹 郑建宇

（右江民族医学院，广西 百色 533000）

研究认为T细胞的激活及其释放的细胞因子是哮喘炎症过程的关键环节［1］。在炎症过程中，Th2细胞起着重要的介导作用，其释放的白介素（IL）-4、IL-5、IL-13等细胞因子与哮喘的炎症反应密切相关，胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP)对Th2细胞优势分化有调控作用。本实验建立哮喘小鼠模型，观察壮医针挑疗法对哮喘模型小鼠 TSLP mRNA及IL-4、IL-5、IL-13的影响，讨论其可能的止咳平喘机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雌性BALB/c小鼠40只，6～8周龄，体质量（26.13±3.14）g，由右江民族医学院科学实验中心购买并提供，合格证编号SCXK（京)2013-0001。小鼠按随机数字表法分4组，即对照组、模型组、针挑组、假针挑组，每组10只。

1.2 试剂和仪器

乌拉坦（国药集团化学试剂有限公司，批号20080610）；卵清蛋白（OVA）（Sigma，USA，批号 s4881）；氯仿（北京化学试剂公司，批号20110322）；异丙醇（北京化学试剂公司， 批号 20100811）；IL-4、IL-5、IL-13 ELISA 试剂盒（R&B 公司，U.S.A）；Trizol（Gibcobrl公司)；M-MLV（Piomegan 公司)；Tag 酶、DNAmark （北京博奥公司)；TSLP基因引物 （Invitrogen公司）。电子天平（AE160型，瑞士Mettler公司）；电动玻璃匀浆机（DY-89型，宁波新芝公司）；超声波细胞破碎机（SONICS型，U.S.A）；高速低温离心机（PK121R型，ALC公司)；超低温冰箱（MDF-U72V型，日本三洋公司）；酶标仪 （MK3型，Thermo Labsystem公司）；凝胶成像系统（chemidoc XRS型，美国伯乐)；PCR 仪（7900HT 型，ABI公司）；紫外分光光度仪（DU530型，Beckman公司）；大号缝衣针（长约 5 cm）；消毒陶瓷片（6 cm×2.5 cm）。

1.3 哮喘小鼠模型制备

参考Perrier等［2］造模方法，加以改良。模型组、针挑组、假针挑组于第1日、4日、7日、10日、13日每日1次，每次1 mL（50 μg/L)分别腹腔内注射OVA混悬液进行基础致敏，第14日将小鼠置于有机玻璃盒中，给予雾化吸入OVA（0.1 mol/LPBS稀释OVA 1 mg），每日30 min，连续1周激发。

1.4 干预方法

针挑组在激发阶段，激发后1 h以消毒大号缝衣针在小鼠颈1、2棘突或胸1、2棘突下及旁开约4 mm（双侧）取穴位，每次取穴位3～4个作为挑刺点，将针尖快速刺入穴位表皮并挑起，挑出皮内少许纤维组织，然后以消毒陶瓷片割裂表皮，以皮肤不出血为宜，之后用针在该针孔垂直快速点刺，刺入皮下1 mm，出针后以酒精涂抹针口。每日1次，7 d为1个疗程。假针挑组用针及陶瓷片按压挑刺点但不挑刺；模型组和对照组不作特殊处理。治疗1个疗程。

1.5 检测项目

1.5.1 肺组织 TSLP mRNA表达水平检测疗程结束后第1日，按5 mL/kg以20%乌拉坦溶液麻醉并固定。眼球取血1.0 mL，3000 r/min离心10 min后收集血清于-70℃保存。用静脉穿刺针插入气管内，结扎左主支气管，将1.0 mL 0.9%氯化钠注射液经留置针气道内注入，来回抽吸支气管肺泡灌洗液，重复3次。取灌洗后的右肺滤纸吸干，-70℃保存，用于检测肺组织TSLP mRNA表达水平。取100 μL肺组织匀浆，用Trizol试剂提取总RNA，氯仿和异丙醇抽提。紫外分光光度仪和琼脂糖电泳鉴定RNA的浓度和纯度，取10μL根据逆转录试剂盒说明逆转录合成cDNA，-70℃冻存备用。取5 μL逆转录产物进行PCR扩增反应，并以βactin为内对照。TSLP基因引物由Invitrogen公司设计合成。PCR反应条件：95℃预变性3 min→95℃变性35 s→62℃退火45 s→70℃延伸45 s。共35个循环，最后70℃延伸10 min。具体序列及扩增长度见表1。

表1 引物序列及扩增长度

PCR扩增反应产物经2%琼脂糖电泳，溴化乙啶染色，通过凝胶电泳分析系统读取目的基因灰度值，将目的基因灰度值与β-actin基因灰度值的比值作为目的基因mRNA的表达量，目的基因mRNA的表达量=目的基因灰度值/β-actin基因灰度值。

1.5.2 IL-4、IL-5和IL-13检测 ELISA法检测，按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 统计学处理

2 结 果

各组 TSLP mRNA相对表达量及 IL-4、IL-5、IL-13水平比较见表2。与对照组比较，模型组的TSLP mRNA相对表达量及IL-4水平均显著升高（P＜0.01）；模型组的IL-5、IL-13水平升高 （P＜0.05）。 和模型组比较，针挑组的IL-4水平显著降低（P＜0.01）；针挑组的TSLP mRNA相对表达量、IL-5及IL-13水平均降低（P＜0.05）。

表2 各组TSLP mRNA相对表达量及IL-4、IL-5、IL-13 水平比较（pg/mL

表2 各组TSLP mRNA相对表达量及IL-4、IL-5、IL-13 水平比较（pg/mL

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

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3 讨 论

哮喘的呼吸道炎症是以Th2细胞活化、嗜酸性粒细胞浸润、气道高反应性（AHR）和血清IgE升高为特征的［3］，Th2细胞活化可释放细胞因子 IL-4、IL-5、IL-13等，通过生物学效应使小气道发生炎症、水肿、痉挛、黏液分泌增多、气管纤维化，使小气道狭窄和变形，气体交换功能发生异常，表现为哮喘患者肺功能不同程度的障碍。

TSLP在不同的组织中着重表达于上皮细胞，在抗原呈体细胞触发Th2在外周变态反应性疾病中起着关键作用［4］，TSLP通过树突状细胞引起Th2优势分化，Th2细胞分化后释放细胞因子IL-4、IL-5、IL-13引起肥大细胞、嗜酸性粒细胞浸润及系列变态炎性反应，使气道发生病理改变导致哮喘发作。TSLP的表达可以调控Th2细胞分化进而影响哮喘的发作，TSLP主要是通过上调Th2细胞的表达使得Th2与Th1的平衡机制向Th2方向倾斜而诱发哮喘等过敏性炎症，同时可检测出 IL-4、IL-5、IL-13 等细胞因子水平的升高［5］，从本实验结果和上述报道结果一致，但TSLP和IL-4、IL-5、IL-13水平是否存在正相关，需进一步的实验观察。

针挑疗法作为壮医的特色治疗技法，是在壮医学理论指导下应用的，壮医专家黄汉儒认为针挑疗法的作用机理是挑刺可以激发人体正气，将郁滞体内的有形或无形之毒从体表针挑点刺点驱出，疏通 “龙路”、“火路”，使“水道”、“气道”、“谷道”畅通，天地人三气同步［6］；林辰教授认为壮医针刺疗法在临床应用较广，对哮喘、头痛、失眠等一些慢性病、疑难症有良好的疗效［7］。本实验观察到，和模型组比较，针挑组的IL-4水平显著降低；针挑组的TSLP mRNA相对表达量、IL-5及IL-13水平均降低，说明针挑疗法可以降低TSLP mRNA表达、IL-4、IL-5、IL-13水平，推测这可能是其起效的机制之一。TSLP对Th2细胞优势分化及相关细胞因子的调控作用对于哮喘的治疗具有指导意义，使靶向TSLP治疗哮喘成为新思维。

［1］ Lees Y，Kim SJ，Kwon SS，et al.Distribution and cytokine production of CD4and CD8T-lymphocyte subsets in patients with acute asthma attacks［J］.Ann Allery Asthma Immuno，2001，86（6)：659-661.

［2］ Perrier C，Thierry AC，Mercenier A，et al.Allergen-specific antibody and cytokine responses，mast cell reactivity and intestinal permeability upon oral challenge of sensitized and tolerized mice［J］.Clin Exp Allergy，2010，40（1)：153-162.

［3］ Rautajoki KJ，Kylaniemi MK，Raghav SK，et al.An insight into molecular mechanisms of human T helper cell differentiation ［J］.Ann Med，2008，40（5)：322-335.

［4］ Zhou B，Comeau MR，De Smedt T，et al.Thymic stromal lymphopoietin as a key initiator of allergic airway inflammation in mice［J］.Nat Immunol，2005，6（10)： 1047-1053.

［5］ AL-Shami A，Spolski R，Kelly J，et al.A role for TSLP in the development of inflammation in an asthma medel［J］.J Exp Med，2005，202（6）：829-839.

［6］ 黄汉儒.壮医理论体系概述［J］.中国中医基础医学杂志，1996，2（6)：3-7.

［7］ 林辰，蒋桂江，陈攀，等.壮医针刺研究的新进展［J］.中国民族医药杂志，2011，17（5）：65-67.