巴豆生物碱对人胃癌SGC-7901细胞PCNA、Ki-67及Bax、Fas表达的影响

宋红春 谷 雨 陆为民 耿燕楠

（1.南京中医药大学，江苏南京210029；2.江苏省中医院，江苏南京210029）

巴豆，系大戟科植物巴豆的种子，味辛，性热。巴豆从很早之前就被用于抗肿瘤治疗，巴豆制剂及其复方对胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌等多种肿瘤的治疗作用已从化学、药理、临床等多方面研究确定。有实验研究证实，巴豆生物碱（CA）能诱导SGC-7901细胞分化，抑制细胞增殖，并诱导其凋亡[1-4]。本文即从体外实验的角度，初步探讨巴豆生物碱抑制SGC-7901细胞增殖及诱导其凋亡的分子机制。

1 实验材料

1.1 细胞株 人胃癌SGC-7901细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 药物与试剂 巴豆生物碱由中国药科大学药理室制备；RPMI 1640培养基、小牛血清、胰蛋白酶购自南京凯基生物科技发展有限公司；免疫组化相关抗体试剂盒购自Bioworld公司；免疫组化MaxVisionTM试剂盒、DAB显色试剂盒购自福州迈新生物公司。

1.3 实验仪器 细胞培养瓶、培养板：Fisher Scientific公司（美国）；微量加样器：Eppendorf公司（德国）；二氧化碳培养箱：3111型，Thermo公司（美国）；台式离心机：80-2型，上海医疗器械 （集团）有限公司；光学显微镜：LEICA DM-1000型，LEICA公司（德国）；MiniSee图像采集系统：康克新柏图文分析软件。

2 实验方法

2.1 细胞培养 SGC-7901细胞接种于含10%灭活小牛血清的 RPMI 1640培养液中，置 37℃、5%CO2培养箱中培养，每日显微镜下观察，待细胞生长状态良好，铺满瓶底时，用0.25%胰蛋白酶溶液常规消化、传代。

2.2 免疫组化法检测巴豆生物碱对SGC-7901细胞PCNA、Ki-67、Bax及Fas表达的影响 取处于对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×105/mL，以2000μL每孔接种于6孔塑料板，6孔塑料板每孔底部交错放置两块24mm×24mm经多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片，置37℃、5%CO2培养箱中培养。待培养24h细胞贴壁后，吸弃旧培养液，每孔加入1000μL不同浓度的巴豆生物碱，使终浓度为 25、50、100、200、400μg/mL，并设 0μg/mL 的空白对照，每个浓度设 3 个复孔。继续培养72h后，取出盖玻片，PBS冲洗，4%多聚甲醛4℃固定过夜，3%H2O2室温孵育20min，滴加一抗4℃过夜，次日滴加二抗，最后DAB显色，苏木素轻染，脱水，透明，封片。

每张细胞片选取6个不同视野在高倍镜下观察，以此来判断细胞染色的着色率。PCNA和Ki-67阳性判断标准是以细胞核出现淡黄色至棕黄色颗粒沉着为阳性细胞，而Bax和Fas主要以胞浆出现淡黄色至棕黄色颗粒沉着为阳性细胞。染色结果以染色阳性细胞数百分比计算，即在观察的高倍视野中，计数100个细胞中阳性细胞所占百分比，并取6个视野的平均值。

2.3 统计学方法 实验重复3次，结果以（x±s）表示。所有数据均采用SPSS16.0统计分析软件进行方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果

如图1和图2中所见，PCNA、Ki-67蛋白主要在胞核中表达，并随着巴豆生物碱浓度的升高，PCNA和Ki-67蛋白表达阳性率降低。如图3和图4中所见，Bax和Fas蛋白表达主要在胞浆中，随着巴豆生物碱浓度的升高，Bax及Fas表达显著增多。见表1。

图1 免疫组化SGC-7901细胞中PCNA蛋白的表达（10×40）

图2 免疫组化SGC-7901细胞中Ki-67蛋白的表达（10×40）

图3 免疫组化SGC-7901细胞中Bax蛋白的表达（10×40）

图4 免疫组化SGC-7901细胞中Fas蛋白的表达（10×40）

表1 各组SGC-7901细胞中PCNA、Ki-67、Bax、Fas蛋白表达阳性率（x±s） %

4 讨论

目前，胃癌的治疗仍以手术治疗为主，联合放化疗，然而仍有部分患者不适宜手术，传统化疗药物有严重的不良反应和化疗耐药，多药耐药是造成肿瘤化疗失败的重要原因之一。因此，研究中药对于肿瘤的作用，开发新型有效的抗肿瘤药物具有广阔的前景。近年来，生物碱类药物在肿瘤防治方面的作用越来越受到人们的重视。

目前认为肿瘤的发生发展与细胞增殖失控和细胞凋亡失衡有关。PCNA、Ki-67是与细胞增殖相关的核抗原，在增殖的细胞中呈阳性表达，反映细胞的增殖活性，是细胞增殖的重要标记物[5-6]。PCNA为S期广泛表达的酸性蛋白，定位于细胞核，S期高水平表达，而在M期和G0期不表达。因此PCNA的阳性程度可直接反映DNA复制的活跃程度。Ki-67表达在G0期和G1早期缺如，在S、G2和M期等细胞中均有表达，其表达活性随细胞周期进展而增加，可准确地反映细胞增殖活性。本研究免疫组化结果显示，随着巴豆生物碱作用浓度的升高，SGC-7901细胞中PCNA、Ki-67表达下降，表明巴豆生物碱抑制SGC-7901细胞增殖的作用机制与其下调PCNA、Ki-67表达相关，并呈浓度依赖性。肿瘤恶性程度与其细胞的增殖速度密切相关，细胞增殖活跃者，其生物学行为不佳，预后不良。巴豆生物碱可抑制SGC-7901细胞的增殖，表明其可一定程度地抑制胃癌的分化和转移，改善预后。

细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，是一种细胞自主的生理性死亡。细胞凋亡与机体清除病毒、抗肿瘤及肿瘤形成均有密切关系，Bcl-2家族蛋白和Fas/FasL系统是重要的凋亡调节因子。根据在细胞凋亡调控中的不同作用，Bcl-2蛋白家族分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白两大类。bax是bcl-2家族中主要的促凋亡蛋白，bax定位于细胞浆，自身可形成同源二聚体或与bcl-2形成异源二聚体。当bax过度表达时，bax本身形成的同源二聚体占主导，则易于发生凋亡[7]。很多细胞凋亡中有bax表达升高，其能通过直接影响线粒体功能和膜的完整性而调节凋亡，并降低细胞凋亡的阈值[8]。bax促进细胞凋亡的机理主要有线粒体渗透性转换、氧化磷酸化和ATP的合成功能被破坏；细胞氧化还原作用改变；线粒体中的凋亡相关分子Apaf-1释放出来，与细胞色素C相互作用，激活胱冬肽酶（caspase）信号转导途径。有研究表明bax表达与肿瘤发生发展过程呈负相关，bax在癌组织中的表达随着病理分级、临床分期的增高而降低，且bax在淋巴结转移的患者中低表达[7]。本研究免疫组化结果显示，巴豆生物碱可调高SGC-7901细胞bax蛋白的表达，并呈浓度依赖性，表明巴豆生物碱可能通过上调bax的表达，促进SGC-7901细胞凋亡，从而抑制胃癌的发生与发展。

Fas是有关细胞凋亡的膜表面分子，是Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员。FasL是Fas配体，属于TNF家族Ⅱ型跨膜蛋白。Fas一旦和其配体FasL结合，诱导Fas形成能传递信号的活性形式Fas三聚体，其中的死亡域可与一种死亡结构域相关蛋白结合，并将凋亡信号传递给caspase-8，caspase-8的激活将产生一系列连锁反应，诱导细胞凋亡[9]。本实验结果表明，随着巴豆生物碱浓度的升高，SGC-7901细胞中Fas表达增多，表明巴豆生物碱能上调SGC-7901细胞Fas的表达，并呈浓度依赖性，说明巴豆生物碱诱导SGC-7901细胞凋亡的作用机制可能与此相关。

胃癌的发生与发展受多基因、多途径的调控，各种因素可协同或拮抗发挥调节作用。本研究从体外角度发现巴豆生物碱对SGC-7901细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用与其下调PCNA、Ki-67表达及上调bax、Fas表达相关。这为我们进一步研究巴豆生物碱抗肿瘤的分子机制打下基础，并为临床应用提供了一定的依据，在胃癌的治疗方面，巴豆生物碱可能成为一种有潜在应用前景的抗肿瘤药物。

[1] 狄洌，许冬青，王明艳，等.巴豆生物碱对人胃癌细胞SGC-7901 p53 基因表达的影响.辽宁中医杂志，2003，30（12）：1019

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[3] 许冬青，王明艳，瞿融.巴豆生物碱对人胃腺癌细胞SGC-7901 Fas基因表达影响的研究.中医药学报，2005，33（2）：9

[4] 王明艳，瞿融，许冬青.巴豆生物碱诱导人胃腺癌SGC-7901细胞凋亡的研究.南京中医药大学学报，2010，26（5）：368

[5] 钱金方.增殖细胞核抗原在常见肿瘤的研究进展.肿瘤基础与临床，2008，21（1）：86

[6] 马文群，李利敏，宋国智.增殖细胞核抗原与肿瘤关系的研究进展.河北医药，2011，33（4）：600

[7] 杨连君.bcl-2，bax与肿瘤细胞凋亡.中国肿瘤生物治疗杂志，2003，10（3）：232

[8] Jrgensmeier JM，Xie Z，Deveraux Q，et al.Bax directly induces release of cytochrome C from isolated mitochondria.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（9）：4997

[9] 陆茜，李宁丽.Fas介导细胞凋亡及相关免疫调节作用.细胞生物学杂志，2006，28（4）：543