纳米材料在体外诊断分析领域的应用

张苏琳，蔡江波，吴 莉，吴郦媛

江苏省食品药品监督管理局认证审评中心，南京市，210002

纳米材料在体外诊断分析领域的应用

【作 者】张苏琳，蔡江波，吴 莉，吴郦媛

江苏省食品药品监督管理局认证审评中心，南京市，210002

纳米材料凭借其良好的生物相容性、高比表面积及高导电活性，已广泛地应用于体外诊断分析领域。结合纳米技术开发出的体外诊断分析工具具有检测限低、灵敏度高、选择性强和检验快速等特点。随着纳米技术难关的不断攻克, 纳米材料已经为临床检验医学领域的发展带来深远影响。

纳米材料；体外诊断

随着临床医学诊疗技术的迅速发展，人们对各种疾病的分析诊断和治疗研究的不断深入，许多传统、常规的体外诊断技术已不能满足临床医学发展的需要，人们对临床生化诊断分析的灵敏度、准确度和特异性等要求越来越高。纳米材料是一门迅速发展的新兴材料学科，纳米材料在体外分子诊断技术领域内的应用越来越广泛。纳米材料具有独特的尺寸依赖性化学或物理性质，包括生物亲和性、催化性、电化学性质、电子转移、磁性、光学性质以及热力学等性质。这些性质，使得它们在生物分析和生物传感器等应用方面具有重要作用，如可以检测金属离子、小分子、蛋白质和核酸生物标志物。也可在其表面上修饰一些抗体、适配体、肽等，使得纳米粒子在体内对特定的基因、蛋白质、细胞或器官具有靶向性[1]。纳米材料与诊断技术融合后具有检测限更低、灵敏度更高、选择性更强等特性，纳米材料与临床诊断分析技术相结合必将史无前例地把临床体外诊断分析学科推向新的发展生长点。

1 纳米材料的结构类型和检测原理

纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1～100) nm 或由它们作为基本单元构成的材料。纳米结构通常是指尺寸在100 nm以下的微小结构。按照空间结构不同，纳米材料可分为纳米颗粒、纳米线、纳米薄膜、纳米块体。根据纳米粒子不同的导电性能，可以分为金属、半导体、绝缘类或磁性纳米粒子几类。

目前，已应用于临床的大部分纳米材料诊断工具的诊断原理仍为传统的生物感应原理，如受体-配体，抗体-抗原，或核酸交互作用等。纳米结构在检测领域内的应用主要分两部分：作为检测标记物或作为分子识别物质的支撑物质。不同纳米结构所具有的物理和化学特性决定了其在检测过程中作为标记物还是支撑物。纳米结构如作为标记物，需要在相关的缓冲液或生物液体中稳定，在要求的环境下可探测，并拥有可以用于与生物分子结合的功能团，因此需要在纳米粒子的表面配上配体以确保其在水中具有稳定的水分散系[2]。

2 纳米材料在体外分析诊断领域的应用

纳米技术在体外诊断分析领域内的应用主要是免疫分析和分子诊断以及一些新兴诊断检测技术方面。纳米粒子与临床诊断试剂结合的发展方向主要是利用现代生物学核心技术制备出基因工程抗体、单克隆抗体，结合纳米新材料、免疫标记技术，创新研制的新型诊断系统及其系列化产品，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、可定量/半定量检测、成本低、试剂保存方便等优点。

2.1 免疫分析

免疫分析是指利用抗原与抗体之间高特异性的反应(即免疫反应)实现对抗体、抗原或相关物质进行检测的分析方法。基于纳米结构的免疫测定技术已主要应用于肿瘤或癌症标记物的检测方面，最常用的是前列腺特异性抗原(PSA)的检测，其余还包括免疫球蛋白和其他病原性疾病抗原的检测。基于纳米技术的免疫测定方法可以检测目前常规检测手段无法检测到的低浓度被测物，这为治疗和诊断拓展了一个新思路。

免疫测定方法与纳米粒子最经典的结合是免疫沉淀法或免疫凝结法。其中的一级抗体和二级抗体与纳米粒子结合后用三明治夹心分析法进行测试。由于纳米粒子独特的光学特性，可以用单一的吸收光谱来观察在最低检测限在ng/mL范围内IgG的结合情况。在癌症标记物领域内有许多基于纳米粒子原理的三明治夹心分析法，如前列腺特异性抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原等在血清中的最低检测限已达到pg/mL范围[2]。采用葡聚糖、聚苯乙烯等纳米材料作为ELISA抗原或抗体或其标记物的载体，大大提高了检测的灵敏度和特异性，对比试验表明：新型纳米粒子诊断试剂的检测灵敏度为96.67%～100%，较传统检测试剂提高5～10倍，克服了传统试剂灵敏度不够的缺点；特异性达到98.3%～100%[3]。

免疫胶体金技术是以胶体金作为标记物，用于抗原抗体检测的一种免疫标记技术，齐玲玲等采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金纳米颗粒，对新城疫单克隆抗体进行标记以制备检测探针，在免疫层析检测试纸条上建立检测新城疫病毒方法，这种方法具有特异、灵敏、稳定、操作简单等特点，符合现场快速检测的要求。此外，将纳米金颗粒应用在一些常规检测方法中还可以起到增强灵敏度的作用。有报道表明，在ELISA 方法中，利用胶体金纳米颗粒具有高表面积的特点，能够比IgG 与更多的辣根过氧化物酶( HRP) 结合，对酶标IgG 进行修饰，从而提高检测灵敏度[4]。纳米级胶体金作为标记物还可以应用于大分子的电镜和光镜的检测，主要应用于免疫层析诊断法和快速免疫金渗滤法等。

碳纳米管具有独特的拉伸强度、化学稳定性、导电性，使其成为提高免疫分析检测灵敏度常用的纳米材料。目前，基于硅纳米线和碳纳米管导电性能改变的直接检测系统的检测下限可以达到ng/mL的水平。它们主要使用试验溶液，很少使用血清样本。Wohlstadter 将单壁碳纳米管和聚乙烯乙烯基乙酸盐结合制成工作电极，放入含有三价铬和硫酸的水溶液中，聚乙烯乙烯基乙酸盐使工作电极表面羧基化并形成紧密的网状结构，再用亲和素修饰，生物素化的甲胎蛋白抗体即可固定在工作电极表面，放入含有甲胎蛋白和标记有发光物质的甲胎蛋白抗体溶液中，进行免疫反应，形成免疫复合物，此方法检测甲胎蛋白(AFP)的线性范围为(0.1～100) nmol/L，检测极限是0.1 nmol/L[5]。目前， 综合了纳米管及纳米粒子介质的电化学检测技术已经可以成功检测fg/mL 级别的待测物质，甚至可以直接对血清样本进行测试。

2.2 分子诊断

分子诊断即核酸诊断技术，包括已经在临床使用的核酸扩增技术(PCR)和在研阶段的基因芯片等技术。核酸扩增技术指以扩增DNA或RNA为手段，从而筛查特定基因的检测技术，目前已经用于病原体检测、特定疾病的早期诊断和体内物质的型别鉴定等不同领域。将纳米材料引入到PCR 技术中，结合了PCR的优点以及纳米材料对DNA 的表面富集能力，能够提高PCR 的灵敏度和特异性，极大地拓宽PCR 技术的应用范围[6]。纳米粒子应用于实时定量PCR 技术，能够为病毒性疾病的准确快速检测提供技术支持。Huang等在日本脑炎病毒RNA 的实时定量反转录PCR反应体系中加入13 nm 的纳米金粒子后， 不但可以提高了反转录PCR 产量，减少了扩增时间，而且提高了低拷贝病毒RNA 基因的检测灵敏度[7]。张俊仙等[8]采用磁纳米捕获技术，将抗结核抗体IgG结合于磁纳米颗粒上，通过抗原－抗体反应从液化后的痰标本中特异地捕获结核分枝杆菌，裂解后释放DNA，进行PCR检测，结果明显提高了PCR检测的灵敏度，阳性率由普通PCR的47.4%提高至82.9%。

基因芯片技术指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。基因芯片技术具有高速度、高通量、高效率、操作简单、并行地监测与之杂交的生物样品的特点。鲁卫平等[9]建立了一种基于纳米金的显色基因芯片技术，真菌核糖体分型技术与纳米金基因芯片技术相结合，用于丝状真菌的检测和鉴定，结果表明该方法不会受到标本类型的影响，可用于临床常见样本中丝状真菌的直接检测。陈清标等[10]应用纳米金标基因芯片对11 个前列腺癌特异性基因靶标进行检测，对各基因表达进行研究，结果显示纳米金标基因芯片检测单链核酸的灵敏度达到80 fmol/L，并可获得定性及半定量结果。

3 其他诊断分析方法

3.1 纳米粒子-DNA生物条码

纳米粒子-DNA生物条码是有效的信号放大和检测系统，因为纳米粒子的比表面积很大，能够结合成百上千条生物条形码，将检测的灵敏度提高了至少2～3个数量级。纳米粒子-DNA生物条码可以实现多种蛋白质、DNA等生物大分子的同步检测，在药物筛选、疾病诊断、基因测序以及环境分析等方面都具有重要的意义。目前在前列腺特异性抗原检测中应用纳米粒子-DNA生物条码检测技术最低检测限已经达到 ag/mL范围。这可以与目前最敏感的免疫PCR和单分子ELISA技术相媲美。该项研究极大地推动了生物条形码传感器平台的商业化进程，目前该项研究已获得美国FDA的批准进入了临床试验阶段[2]。

纳米粒子-DNA生物条码技术目前在诊断分析领域已经应用于检测多种重要的蛋白质，如病原标记物，肿瘤标记物等。Stoeva等人将纳米粒子-DNA生物条码技术用于多种蛋白质肿瘤标记物的同步检测。他们选用前列腺特异性抗原PSA，促性腺激素HCG和甲胎蛋白AFP三种蛋白质的多抗和条形码DNA分别修饰到30 nm的金纳米粒子上，将三种蛋白质的单抗分别修饰到磁性微球上，得到三种纳米粒子-DNA生物条形码和三种修饰了不同捕获探针的磁性微球。其中，每种蛋白质对应的条形码DNA的序列不同，在用金标银染法检测的时候结合芯片技术就可以区分蛋白质的种类。他们采用类似的方法应用纳米粒子-DNA生物条码技术还实现了多种DNA的同时检测[11]。

3.2 生物传感器

尽管PCR技术和生物条码技术具有很高的敏感性，但是由于需要庞大的仪器来分析结合活动，所以不适合临床快速诊断系统。因此，使用纳米材料的生物传感器检测技术有着光明的前景。生物传感器是采用生物活性物质（如酶、微生物、抗体等），用于检测与识别生物体内的化学成分的传感器。使用纳米粒子、纳米线和纳米管等不同标记物和信号放大技术极大地提高了生物传感器的灵敏度。在1维纳米结构传感器的直接非标记检测技术中，只要将试验溶液滴在传感器表面，分析物的结合活动就会被纳米结构的DNA作用探针敏感地记录下来。有报道称一项使用碳纳米管在缓冲溶液中检测项目的检测限达到了attomolar级别（1 800分子/30 μL）。即使在目标DNA占总DNA集合的2%的不同混合物溶液中，也可以达到这种敏感度。有报道称使用硅纳米线和电化学介质分析最低检测限可达femtomolar级别[2]。

电化学免疫传感器是新型生物传感器之一，其利用了抗原和抗体特异性结合前后能导致电化学信号改变的特性。在电化学免疫传感器的研究领域内，以纳米金单层作界面固定抗体时，增加了抗体的固定量, 使得电化学免疫传感器具有传感界面不需活化、检测时非特异性吸附小、灵敏度高和传感器能反复再生等优点[12]。Tian等以金纳米颗粒修饰金电极，将羊抗人免疫球蛋白固定在修饰电极上，与人免疫球蛋白进行免疫反应，与异鲁米诺标记人免疫球蛋白的二抗形成夹心式免疫复合物，其检测线性范围为(5.0～100) ng/mL，检测限1.68 ng/mL。

3.3 纳米孔技术

传统用于DNA 测序的方法技术要求高、成本贵、仪器庞大，而且容易出错，理想的方式是使用纳米级别的阅读器直接读出组成序列从而鉴别被分析物的DNA或RNA。20 世纪90 年代中期，纳米孔技术应运而生，该技术不需要扩增或标记，也不需要昂贵的读取仪器，纳米孔DNA 测序技术是最有希望实现全基因测序的“1 000 美金”计划。纳米孔技术可以对极微小的物质如离子、分子等实现精确的控制、运输，而且能够实现在极少溶液条件下的高通量检测与分析，纳米孔技术已被用于制备生物、化学反应传感器，用于生物分子的检测筛选、以及DNA 分子的快速测序等[13]。纳米孔测序是借助测量电泳驱动单分子通过纳米孔时电流变化来实现的。通过纳米孔的DNA的数量或组成不同，电阻值水平也不同。为了优化检测信号，蛋白质纳米孔可以通过在基因水平修改进行控制，如增加识别位点等[6]。近年来一些新的生物纳米孔被开发出来应用于DNA 分子检测，2010 年，Ian M. Derrington等采用耻垢分支杆菌蛋白A 代替α-溶血素作为生物纳米孔实现了对约100 bp的DNA 序列的测量，实现了对DNA 碱基排列顺序的测量。2012 年，Makusu Tsutsui等采用二氧化硅纳米孔道探测DNA 分子序列。他们采用横向内嵌金电极形成的横向电场，使得DNA 分子在纳米孔道内的运动速度减少了400 倍，极大的提高了DNA 测序的精确度，降低了对检测仪器灵敏度的要求，实现了对DNA 分子更为准确的控制[14]。

纳米材料在体外分析诊断研究领域拥有广阔的前景，尽管如此，纳米材料在完全应达到实用阶段还面对许多挑战性问题，比如纳米颗粒的有效分散、纳米结构保留生物分子活性的同时表面的最佳化学特性、纳米材料制造的重现性、实际应用中的基质效应和生物标记后稳定性等一系列问题。今后有关纳米材料在体外分析诊断领域的研究主要侧重于两个方面：(1)结合现代分析手段，不断深化基于纳米材料特性的分析检测方法；(2) 寻找新的纳米材料，推进其在体外分析诊断领域中的应用。纳米材料在该领域未来的发展需要临床检验医学、化学、生物学、材料学等方面的专家进行更深入的合作。随着纳米技术难关的不断攻克，其在生物学和医学领域中的应用将进一步加强, 未来人类的许多疾病将被更加快速、准确、高效地分析和揭示，纳米材料必将给临床检验医学领域的发展带来深远影响。

[1] 王萍, 毛红菊. 纳米材料在生物医学检测中的应用[J]. 中国生物工程杂志, 2011, 31(9) : 88-95

[2] Kurkina T, Balasubramanian K. Towards in vitro molecular diagnostics using nanostructures[J]. Cell Mol Life Sci, 2012, 69(3): 373-388.

[3] 陈静静, 顾耀亮. 纳米粒子新型诊断试剂平台开发的必要性[J].广东化工, 2010, 37(4): 13-14.

[4] 王燕飞, 邹明强, 郭浩. 纳米颗粒在分析检测领域的应用[J]. 化学试剂, 2011, 33( 10): 865- 866, 870.

[5] 陈钰, 王捷, 刘仲明. 基于纳米材料的电化学发光免疫传感器[J].免疫学杂志, 2011, 27(1): 81-85.

[6] 洪敏, 朱进, 尹汉东. 纳米材料应用于DNA检测领域的研究进展[J]. 分析化学, 2011, 39(1): 146-154.

[7] 刘清岱, 王金菊, 王勇. 纳米粒子PCR研究进展[J]. 生物学通报, 2010, 45 (2):1-3.

[8] 张俊仙, 吴雪琼, 刘银萍,等.应用磁纳米捕获-PCR技术检测痰液结核分枝杆菌的研究[J]. 中国病原生物学杂志, 2012, 7(4): 252-253.

[9] 鲁卫平, 陈星云, 杨楠. 纳米金基因芯片技术快速检测丝状真菌的研究[J]. 激光杂志, 2010, 31(5): 61-62.

[10] 陈清标, 蔡超, 陈佳鸿, 等. 纳米金标芯片检测用于前列腺癌多基因诊断的实验研究[J]. 现代泌尿生殖肿瘤杂志, 2011, 3(1): 22-25.

[11] 沈丽, 李翌晗, 徐晓东, 等. 纳米粒子-DNA生物条形码技术研究进展[J]. 化学传感器, 2007, 27(4): 1-7.

[12] 刘艳, 牛卫芬. 纳米金在电化学免疫传感器中的应用[J]. 长江大学学报, 2010, 7 (3): 460-462.

[13] Shinde SB, Fernandes CB, Patravale VB. Recent trends in in-vitro nanodiagnostics for detection of pathogens[J]. J Control Release, 2012, 159: 164-180.

[14] 乔奇巍, 李丹, 杨媛媛, 等. 纳米孔DNA 分子特性检测技术进展[J]. 西北大学学报, 2012, 10 (4): 1-6.

Application of Nanomaterials in In-Vitro Diagnostics

【 Writers 】Zhang Sulin, Cai Jiangbo, Wu Li, Wu Liyuan
Jiangsu Certi fi cation Center, Food & Drug Administration, Nanjing, 210002

nanomaterials, in-vitro diagnostics

R446.6

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2014.02.011

1671-7104(2014)02-0118-04

2013-07-23

张苏琳，E-mail: 56469289@qq.com

【 Abstract 】Nanomaterials appear to be promising for a number of applications in in-vitro diagnostics, mainly due to the biocompatibility，specific surface and conduction activity. The use of nanostructures as diagnostic tools has the advantage of very low limit of detection achievable, high sensitivity，strong selectivity and the possibility to fabricate point-of-care diagnostic devices. With the problems of nanotechnology solved，nanomaterials had already put a broad impact in the fi eld of clinical medical examination.